小麦叶片上潜伏期条锈菌的巢式PCR检测及小麦与条锈菌互作中相关激酶类基因的表达谱分析

摘要

第一部分小麦叶片上潜伏期条锈菌的巢式PCR检测由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp．Tritici)引起的小麦条锈病是世界范围内小麦生产上的一个重要病害，主要发生在气候凉爽潮湿的地区。在条锈菌夏孢子越冬时期，被病原菌侵染的小麦叶片在潜伏期不表现任何症状，一种快速可靠的检测方法有助于提早预测小麦条锈病的爆发，有效控制病害发生。 基于组织学，形态学等检测小麦条锈菌的传统方法费时耗力，还需要具备丰富的植物病理学知识。为加速并简化小麦条锈菌的检测方法，本研究建立了利用特异性高，灵敏度好的巢式PCR方法对小麦条锈菌进行检测。 1.引物特异性检测。根据小麦条锈菌的PSR序列设计特异引物Pstl-Pst2，利用小麦条锈菌7个不同的生理小种夏孢子及6种其他小麦病原菌DNA为模板检测其特异性。小麦条锈菌的7个生理小种都产生约470bp的目的条带，而其他小麦病原菌无产物。这说明，引物Pst1-Pst2具有小麦条锈菌特异性，而无小种特异性，适于小麦条锈菌的检测。 2.巢式PCR检测小麦条锈菌。第一轮PCR．反应以依次稀释10倍的小麦条锈菌DNA为模板，利用引物Pst1-Pst2扩增，可检测到1pg小麦条锈菌。第二轮PCR反应以第一轮PCR产物为模板，利用内引物Nestl-Nest2扩增，检测灵敏度可达1fg。利用接种条锈菌的小麦叶片基因组DNA为模板，巢式PCR在接种24h后即可检测到病原菌的存在。 巢式PCR特异性强，灵敏度高，在小麦条锈菌侵染早期即可检测到微量病原菌，为小麦条锈病的早期诊断提供了有利工具。第二部分小麦与条锈菌互作中相关激酶类基因的表达谱分析蛋白激酶是酶中的一个大家族，其可逆蛋白磷酸化作用在所有真核细胞基础功能调节中起重要作用，如细胞周期控制、能量代谢、细胞与细胞之间的通讯和介导与周围环境的复杂相互作用等。 为阐明小麦．小麦条锈菌互作过程中的一些分子事件及有关蛋白激酶的功能，本研究在本实验室已建立的小麦与小麦条锈菌互作非亲和/亲和组合cDNA文库及小麦与小麦条锈菌互作非亲和/亲和组合SSH文库中挑选蛋白激酶类基因，通过斑点杂交检测其在小麦与条锈菌互作中的表达趋势。选取表达水平有明显变化的蛋白激酶类基因，通过实时荧光定量PCR更精确的检测小麦条锈菌感染小麦过程中，小麦相关激酶类基因表达水平的变化。 1.斑点杂交检测小麦相关蛋白激酶类基因表达趋势。在实验室已建立的小麦与小麦条锈菌互作非亲和/亲和组合cDNA文库及小麦与小麦条锈菌互作非亲和/亲和组合SSH文库中挑选出94个蛋白激酶类基因的EST序列。对挑选出的93个EST质粒进行斑点杂交，检测在亲和及非亲和组合中，小麦在接种条锈菌0h，18h，24h，48h，72h后表达水平的变化。检测根据杂交结果，挑选出30个表达水平变化明显的激酶类基因。 2.相关激酶类基因的real-time PCR分析。以18SrRNA持家基因为内参，利用SYBRGreen I real-time PCR方法分析了19个激酶类基因在亲和及非亲和组合中，小麦在接种条锈菌0h，12h，18h，24h，48h，72h，120h后表达水平的变化。在非亲和组合中，多数蛋白激酶类基因在条锈菌侵染前期表达量较高，尤其在接种后12h和24h，可能参与植物感受病原菌刺激的信号转导过程。另外一些表达量基本没有变化或者在亲和及非亲和组合中表达趋势基本一致，可能为组成型表达基因或与植物其他抗逆反应或生物学功能有关. 由于小麦基因组的复杂性，使小麦蛋白激酶的研究还属于零星的研究，远未能形成对蛋白激酶在各反应中的完整认识。小麦与条锈菌的互作是一个很复杂的过程，互作中小麦蛋白激酶的研究将为小麦的基础代谢、抗逆和抗病害的机理研究奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分小麦叶片上潜伏期条锈菌的巢式PCR检测

第一章文献综述

1.1小麦条锈病

1.2巢式PCR

1.3本研究的目的和意义

第二章材料与方法

2.1试验材料

2.2实验方法

第三章结果与分析

3.1 DNA的提取

3.2引物通用性检测

3.3引物特异性检测

3.4巢式PCR灵敏度检测

3.5巢式PCR检测被小麦条锈菌侵染的小麦叶片

第四章讨论

4.1小麦条锈菌基因组DNA的提取

4.2巢式PCR特异性与灵敏度的检测

4.3巢式PCR检测被小麦条锈菌侵染的小麦叶片

4.4进一步研究设想

第五章结论

参考文献

第二部分小麦与条锈菌互作中相关激酶类基因的表达谱分析

第一章文献综述

1.1植物与病原物互作相关基因

1.2植物和小麦蛋白激酶

1.3实时定量RT-PCR(Quantitative reverse transcriptase-PCR)

1.4本研究的目的和意义

第二章试验材料与方法

2.1试验材料

2.2试验方法

2.2 RNA反转录

2.3蛋白激酶类基因的筛选

2.4斑点杂交(Dot blot)

2.5实时荧光定量PCR

第三章结果与分析

3.1小麦叶片总RNA的提取与质量检测

3.2反转录产物检测

3.3斑点杂交结果

3.4实时荧光定量PCR条件的优化

3.5 18SrRNA标准曲线的建立

3.6激酶类基因实时荧光定量PCR结果

第四章讨论

4.1斑点杂交(Dot blot)

4.2实时荧光定量PCR扩增条件优化

4.3实时荧光定量PCR影响因素及注意事项

4.4实时荧光定量PCR分析激酶表达变化

4.5进一步研究设想

第五章结论

参考文献

附 录

致谢

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