胶原酶产生菌的鉴定及所产胶原酶酶学特性研究

摘要

目的：分离、纯化并鉴定人初乳样本中具备蛋白水解能力的菌株，进一步确定产酶菌株胶原酶的编码基因以及分子结构特性，最终利用大肠杆菌原核表达系统进行原核表达，并对表达的重组酶进行纯化以及酶学性质研究。
　　方法：以牛奶平板培养法分离并纯化产酶菌株，利用16Sr DNA序列分析以及API CH50培养基分析菌株的遗传特性与生化特性，最终鉴定产酶菌株所属类型。其次，利用串联质谱技术分析产酶菌株所产酶的类型，再结合质谱分析结果以菌株基因组DNA为模板采用PCR法获得胶原酶colR75E基因，构建pET28a/colR75E重组质粒，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，利用Ni-NTA纯化的方式获得高纯度ColR75E胶原酶，利用胶原酶谱、胶原酶活力测定、Ⅰ型胶原蛋白降解产物电泳检测等方式对ColR75E胶原酶的酶学特性进行分析。
　　结果：通过16Sr DNA序列分析以及API CH50培养基分析可知人初乳样本中的产酶菌株为一株蜡样芽孢杆菌，根据串联质谱结果结合生物信息学分析可知产酶菌株所产的蛋白酶为一种可分泌至胞外的胶原酶，对该酶进行基因克隆及原核表达后，通过Ni-NTA纯化获得的蛋白经胶原酶谱、Ⅰ型胶原蛋白降解产物的检测时均表现出胶原蛋白的降解能力。在标准条件下测得其比活力为3.62 U/mg，Km为25.55μmol/L（2.93 mg/mL），Vmax为5.71μmol/(mg?min)。ColR75E胶原酶的最适反应温度为45℃，最佳反应pH为8.0。此外，ColR75E胶原酶对于不高于50℃的温度以及pH6.0-8.0的酸碱度范围具有良好的稳定性。ColR75E胶原酶可被Ca2+激活、但被Zn2+、Pb2+、Fe2+、Mn2+等金属离子抑制，抑制能力依次为Pb2+＞Zn2+＞Fe2+＞Mn2+。ColR75E胶原酶对EDTA和EGTA的高敏感性进一步证实了该胶原酶为一种金属蛋白酶。
　　结论：本研究分离鉴定了一种可分泌胶原酶的蜡样芽孢杆菌，构建了相应胶原酶的原核表达系统，最终证实利用原核表达系统大量获得高纯度高活性的蜡样芽孢杆菌胶原酶是可行的，为该胶原酶广泛应用于医疗、食品等工业领域中奠定了理论基础。

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第一章 前 言

1.1 课题的研究背景

1.2 课题的研究重点

第二章 胶原酶产生菌的筛选与鉴定

2.1 研究依据及意义

2.2 研究内容

2.3 实验材料

2.4 实验方法

2.5 结果

2.6 讨论

第三章 蜡样芽孢杆菌R75E所产胶原酶基因的鉴定及原核表达

3.1 研究依据及意义

3.2 研究内容

3.3 实验材料

3.4 实验方法

3.5 结果

3.6 讨论

第四章 重组胶原酶ColR75E的酶学性质分析

4.1 研究依据及意义

4.2 研究内容

4.3 实验材料

4.4 实验方法

4.5 结果

4.6 讨论

第五章 总结与展望

5.1 研究结论

5.2 研究的创新点

5.3 研究展望

参考文献

发表论文、参加科研情况说明

附录

致谢