Cu和Cd对皱纹盘鲍幼鲍的毒性及饲料硒和硫辛酸对其解毒作用的研究

摘要

本文以我国北方主要养殖贝类之一—皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)为研究对象,采用静水系统进行摄食生长试验。研究重金属Cu和Cd对皱纹盘鲍的毒性作用,并探讨饲料中的硒和硫辛酸对其解毒作用的影响,主要的研究内容和结果如下:
　　1、为了研究不同浓度的水体铜对皱纹盘鲍存活率、抗氧化能力、脂质过氧化及组织Cu积累量的影响,采用0.02、0.04、0.06、0.08mg/LCu2+分别刺激皱纹盘鲍0、1、3、6、10、15、21、28天后,测定皱纹盘鲍肝胰脏抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GPx、谷胱甘肽硫转移酶GST)、抗氧化小分子谷胱甘肽(GSH)、总抗氧化力(T-AOC)、丙二醛(MDA)的含量以及肝胰脏和肌肉组织中Cu积累量。结果发现,在0.04mg/L、0.06mg/L和0.08mg/LCu2+浓度下,皱纹盘鲍分别在实验的第21天、第10天和第6天全部死亡。在0.02mg/LCu2+浓度下,皱纹盘鲍在28天内存活率为100％。大体上来说,肝胰脏SOD和GST的活力随着时间的延长而呈下降的趋势, CAT和GPx的活力及GSH的含量在各Cu浓度下均高于对照组,肝胰脏T-AOC在各Cu离子浓度下呈下降的趋势。在0.02mg/LCu2+浓度下,MDA的含量显著升高后降低到对照水平。在0.04、0.06、0.08mg/LCu2+浓度下,MDA的含量均高于对照组。皱纹盘鲍肝胰脏和肌肉中Cu积累量随着浓度的增加和时间的延长呈上升的趋势。结果表明,在各Cu离子浓度下,Cu离子胁迫导致了皱纹盘鲍的氧化应激,CAT、GPx和抗氧化小分子GSH在抵抗Cu的氧化胁迫中发挥了重要的作用。而且Cu离子的胁迫导致了机体的脂质过氧化水平的提高,从而导致了皱纹盘鲍的死亡。
　　2、本试验以初始重量为(3.17±0.01)g的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)为研究对象,在其饲料中分别添加硒0.10、1.31和4.20mg/kg配制成3种半精制饲料,在Cu含量为0.02mg/L的静水养殖系统中饲养2个月,探讨饲料中的硒对皱纹盘鲍解毒中的作用。实验利用同源克隆技术和 RACE技术从皱纹盘鲍的肝脏中成功扩增出金属硫蛋白(metallothionein, MT)和金属转录因子(Metal transcription factor-1, MTF-1)。MT基因全长cDNA序列包含个551bp,其中包括108bp的5’非编码区、255bp的3’非编码区和188bp的开放阅读框。其中开放阅读框编码69个氨基酸,预测分子量约为6.996KDa,理论等电点为5.16。MTF-1基因cDNA全长为2278bp,包括25bp的5’非编码区、626 bp的3’非编码区和1566bp的开放阅读框,开放阅读框编码522个氨基酸,预测分子量约为59.63 KDa,理论等电点为5.61。饲料中不同的硒添加水平对Cu胁迫下皱纹盘鲍生长和存活无显著性影响。1.31mg/kg硒实验组显著降低了皱纹盘鲍肝胰脏和血清中的 Cu含量,且1.31mg/kg硒实验组鳃、外套膜、肌肉和贝壳中的Cu含量均低于对照组。饲料中的硒显著升高了肝胰脏TrxR的活力和GSH的含量。1.31mg/kg硒实验组肝胰脏MDA的含量和蛋白羰基含量均显著低于对照组。实验对皱纹盘鲍利用实时荧光定量PCR技术进行HdhMT及HdhMTF-1的表达分析。分析表明皱纹盘鲍肝胰脏中MT含量、HdhMT和HdhMTF-1mRNA表达水平呈现先升高后降低的趋势,即在1.31mg/kg的硒饲料组中的表达量最高,但是在4.20mg/kg的硒饲料组中表达量降低。上述的研究结果表明,硒的添加在一定程度上可以提高Cu胁迫下的皱纹盘鲍的抗氧化水平,降低脂质过氧化的水平和蛋白羰基水平。而且MT的mRNA的表达和蛋白含量及上游调控因子MTF-1受到饲料中硒含量的影响,说明 MT可能在皱纹盘鲍抗 Cu的毒性中发挥重要的作用。总体来说,1.31mg/kg的硒缓解Cu毒性的效果要好于4.20mg/kg。
　　3、本试验以初始重量为(3.17±0.01)g的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)为研究对象,在其饲料中分别添加α-硫辛酸0、0.7和2.1g/kg配制成3种半精制饲料,在Cu含量为0.02mg/L的静水养殖系统中饲养2个月,探讨饲料中的硫辛酸对皱纹盘鲍抗Cu毒性中的作用。在Cu离子的胁迫下,皱纹盘鲍的特定生长率(SGR)随着饲料中LA的增加而升高,但与对照组并无显著性的差异。0.7g/kg和2.1g/kg硫辛酸实验组皱纹盘鲍血清、外套膜、鳃、和肝胰脏中Cu含量显著低于对照组,2.1g/kg硫辛酸实验组的肌肉中Cu的含量显著低于对照组,但是0.7g/kg硫辛酸实验组肌肉Cu含量与对照组无显著差异。各LA处理组显著升高Cu胁迫下的皱纹盘鲍肝胰脏SOD、CAT、Se-GPx、GST的活力及GSH的含量。0.7g/kg组和2.1g/kgLA实验组的肝胰脏MDA的含量显著低于对照组。2.1g/kgLA实验组的蛋白羰基的含量和DNA断裂损伤显著低于对照组和0.7g/kg。0.7g/kg和2.1g/kg实验组的MT含量显著高于对照组。0.7g/kg实验组的MTmRNA表达显著高于对照组,并且0.7g/kg和2.1g/kgLA实验组的MTF-1mRNA的表达均显著高于对照组。上述的研究结果表明,硫辛酸的添加可以提高Cu胁迫下的皱纹盘鲍肝胰脏抗氧化水平,在一定程度上可以降低肝胰脏 MDA的含量、蛋白羰基水平及DNA的断裂。而且MT的mRNA的表达和蛋白含量及MT被上游调控因子MTF-1调控的路径受到饲料中硫辛酸含量的影响,说明MT可能在皱纹盘鲍抗Cu的毒性中发挥重要的作用。
　　4、为了研究不同浓度的水体 Cd对皱纹盘鲍存活率、抗氧化能力、脂质过氧化及组织Cd积累量的影响,采用0.025、0.05、0.25、0.5mg/LCd2+分别刺激皱纹盘鲍0、1、3、6、10、15、21、28天后,测定皱纹盘鲍肝胰脏抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GPx、谷胱甘肽硫转移酶 GST)、抗氧化小分子谷胱甘肽(GSH)、总抗氧化力(T-AOC)、丙二醛(MDA)的含量以及肝胰脏和肌肉组织中Cu积累量。结果发现,在各浓度Cd浓度下,皱纹盘鲍在28天内存活率均为100%。皱纹盘鲍肝胰脏和肌肉中Cd积累量随着浓度的增加和时间的延长呈上升的趋势,且肝胰脏的Cd积累量大于肌肉。大体上来说,在各浓度Cd胁迫下,肝胰脏CAT、SOD和GST的活力随着时间的延长而呈下降到对照水平又升高的趋势,肝胰脏GSH的含量随着时间的延长先升高后降低,然后又变化的过程。然而,GPx的活力随着时间的延长呈下降的趋势。在0.05mg/L、0.25mg/L、0.5mg/LCd2+胁迫下,T-AOC的活力随着时间的延长先升高后降低到对照水平然后又升高的过程。SOD的活性第1天就发生了显著性的变化,GST、GSH和T-AOC在实验的第3天发生显著性的变化, CAT和GPx在实验的第6天发生了显著性变化。在各Cd浓度下,MDA的含量和对照组均无显著性差异。结果表明,在各Cd离子浓度下,Cd离子胁迫导致了的机体氧化应激,SOD、CAT、GST和抗氧化小分子GSH发挥重要的作用,且最敏感的的指标为SOD,其次为GST、GSH和T-AOC。Cd离子的胁迫并未影响肝胰脏的脂质过氧化水平,推测原因可能是皱纹盘鲍抗氧化系统的抵抗作用。
　　5、本试验以初始重量为(3.17±0.01)g的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)为研究对象,在其饲料中分别添加硒0.10、1.31和4.20mg/kg配制成3种半精制饲料,在Cd含量为0.35mg/L的静水养殖系统中饲养2个月,探讨饲料中的硒对皱纹盘鲍抗Cd毒性的作用。在Cd离子的胁迫下,饲料中不同的硒添加水平对Cd胁迫下皱纹盘鲍生长和存活率无显著性影响,并且4.20mg/kg硒饲料组的SGR最大。在血清、肝胰脏、外套膜和鳃中,1.31mg/kg和4.20mg/kg硒处理组的Cd含量显著低于对照组。在肌肉组织中,4.20mg/kg处理组的Cd含量显著低于1.31mg/kg硒的处理组及对照组。饲料中硒的添加可以显著升高Cd胁迫下的皱纹盘鲍肝胰脏Se-GPx、TrxR、TPx的活力及GSH的含量。1.31mg/kg组和4.20mg/kg硒饲料组的肝胰脏 MDA的含量和蛋白羰基含量、DNA的断裂均显著低于对照组。1.31mg/kg和4.20mg/kg的饲料组皱纹盘鲍肝胰脏MT的含量均显著高于对照组。上述的研究结果表明,饲料中硒的添加可以提高Cd胁迫下的皱纹盘鲍肝胰脏抗氧化水平,降低Cd胁迫下的肝胰脏MDA的含量、蛋白羰基水平及DNA的断裂。而且肝胰脏MT的含量受到饲料中硒含量的影响,说明MT可能在皱纹盘鲍抗Cd的毒性中发挥重要的作用。
　　6、本试验以初始重量为(3.17±0.01)g的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)为研究对象,在其饲料中分别添加α-硫辛酸0、0.7和2.1g/kg配制成3种半精制饲料,在Cd含量为0.35mg/L的静水养殖系统中饲养2个月,探讨饲料中的硫辛酸对皱纹盘鲍抗Cd毒性中的作用。饲料中不同的LA添加水平对Cd胁迫下皱纹盘鲍生长和存活均无显著性影响。0.7g/kg和2.1g/kg硫辛酸实验组皱纹盘鲍血清、外套膜、鳃、和肝胰脏中Cd含量显著低于对照组,2.1g/kg硫辛酸实验组的肌肉中Cu的含量显著低于对照组,但是0.7g/kg硫辛酸实验组肌肉Cu含量与对照组无显著差异。LA的添加可以显著升高Cd胁迫下的皱纹盘鲍肝胰脏CAT、Se-GPx、GST的活力及GSH的含量。0.7g/kg和2.1g/kgLA实验组的肝胰脏蛋白羰基的含量和DNA的断裂显著低于对照组,2.1g/kg LA实验组的肝胰脏MDA的含量显著低于对照组和0.7g/kg实验组。0.7g/kg和2.1g/kg实验组的MT含量、MTmRNA和 MTF-1mRNA的表达均显著高于对照组。上述的研究结果表明,硫辛酸的添加可以提高Cd胁迫下的皱纹盘鲍肝胰脏抗氧化水平,在一定程度上可以降低肝胰脏MDA的含量、蛋白羰基水平及DNA的断裂。而且MT的mRNA的表达和蛋白含量及上游调控因子MTF-1受到饲料中硫辛酸含量的影响,说明MT和MT被上游调控因子 MTF-1调控的路径可能在皱纹盘鲍抗 Cd的毒性中和降低组织Cd含量中发挥重要的作用。

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引言

第 一 章文 献 综 述

1 Cu和Cd的污染现状

2 Cu和Cd对机体的毒性

3 重金属的解毒机制

4 研究的目的和意义

参考文献

第二章水中Cu对皱纹盘鲍抗氧化反应、脂质过氧化和体内金属积蓄的影响

1前言

2材料与方法

3实验结果

4讨论

参考文献

第三章饲料硒解除Cu对皱纹盘鲍毒性作用的研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第四章饲料硫辛酸解除Cu对皱纹盘鲍毒性作用的研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4、讨论

参考文献

第五章水中Cd对皱纹盘鲍抗氧化反应、脂质过氧化和体内金属积蓄的影响

1 引言

2 材料与方法

3 实验结果

4 讨论

参考文献

第六章饲料硒解除Cd对皱纹盘鲍毒性作用的研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第七章饲料硫辛酸解除Cd对皱纹盘鲍毒性作用的研究

1引言

2 材料与方法

3结果

4讨论

全文总结

参考文献

附表和图

致谢