甲胎蛋白特异性siRNA表达载体的构建及其在胃癌细胞株FU97中沉默效应的鉴定

摘要

目的甲胎蛋白(AFP，alpha—fetoprotein)自被发现以来，作为一个胎儿异常和肿瘤的标志物，在临床诊断和病情监测等方面发挥了重要作用，其在临床中的意义受到人们的充分研究。然而这几十年中，甲胎蛋白的生理学功能及其在肿瘤发生发展中的生物学作用受到的关注却相对较少，只是在最近十年中人们才意识到甲胎蛋白在肿瘤生长中的调节作用并开始实验研究。我们以可特异表达甲胎蛋白的人类胃腺癌细胞株(AFP—producing gastric adenocarcinoma cell line，FLl97)为研究目标，利用RNA干涉技术，针对甲胎蛋白基因的不同靶序列，构建了三个能在哺乳动物细胞中表达小发夹RNA的表达质粒，pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector-AFP-siRNAl/2/3(简写为pDonorVector-AFP-siRNAl/2/3)，分别观察其在FU97中对甲胎蛋白基因的沉默作用，并研究抑制甲胎蛋白基因后对此肿瘤细胞生长及凋亡的影响，由此我们可以研究甲胎蛋白在AFP相关肿瘤发生发展中的作用，并探讨其在AFP相关肿瘤的基因治疗方面潜在的应用价值。方法首先选择3个符合条件的AFP特异性RNA干涉靶序列，这三段序列分别为：①CAGGGAGACATTCATGAAC，起始于508位，GC含量为47％②CTGGAACGTGGTCAATGTA，起始于968位，GC含量为47％③GGCTGACATTATTATCGGA，起始于1474位，GC含量为42％；然后分别体外合成两段互补的寡核苷酸，与线性载体pSIREN-DNR-DsRed-Express Dotlor Vector连接；确定构建成功后，利用转染试剂将3个重组质粒(pDonor Vector-AFF-siRNAl/2/3)和对照质粒(包括阳性对照，阴性对照，空白对照)分别导入FU97中，同时此载体可独立表达DsRed荧光蛋白，转染后8至12小时在荧光显微镜下可通过直接观察荧光蛋白的表达来计算质粒的转染效率，而不影响siRNA沉默的效果；然后在质粒转染入肿瘤细胞48小时后，用相对定量RT-PCR法检测AFP基因在mRNA水平的变化，而AFP蛋白水平的表达变化则通过化学发光免疫分析仪检测培养上清，结合免疫细胞化学法来检测；最后通过MTT实验及流式细胞术(Annexin V/PI双染色法)，检测抑制AFP基因后对FU97细胞生长及凋亡的影响。 结果基因测序结果表明插入片段的序列与合成的AFP寡核苷酸序列完全相符，即成功构建pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor VectotAFP-siRNA1/2/3载体；转染后，荧光显微镜下DsRed荧光蛋白表达率达30％，说明质粒的转染效率可达30％；RT-PCR结果表明在mRNA水平，所构建的三个质粒都可抑制AFP基因的表达；培养上清的结果进行统计学分析显示实验组三组(pDonorVector-AFP-siRNAl/2/3)与空白对照组之间的AFP水平均不同(P<0.01)；MTT实验表明抑制了AFP基因表达后能够明显抑制FU97的生长；用流式细胞术(AnnexinV/PI双染色法)检测发现抑制了AFP基因表达后，可诱导肿瘤细胞的凋亡。 结论首次在特异表达AFP的人胃腺癌细胞株中，利用构建的siRNA表达载体明显干扰AFP的mRNA及蛋白的表达，同时发现抑制AFP基因的表达能够直接抑制人胃腺癌细胞株FU97的生长并诱导其凋亡，为探讨甲胎蛋白在AFP相关肿瘤的基因治疗方面的应用价值奠定了理论基础。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

摘要

符号说明

前言

材料

方法

结果

讨论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文