干预β-淀粉样前体蛋白裂解酶基因减少神经细胞β淀粉样蛋白的产生

摘要

随着人类平均寿命的不断延长，阿尔茨海默病（Alzlleimer's disease，AD）越来越成为影响老年人生活的一大疾病。在国外阿尔茨海默病是导致老年人智能损害的最常见原因，超过65岁的人群中有大约5-10％的人患有阿尔茨海默病，而85岁以上的老年人有超过一半的人患有阿尔茨海默病。在国内，我们一度认为血管性痴呆的发病率高于AD，但是最近几年的流行病学调查显示，AD在我国的发病率也处于各种痴呆的第一位。阿尔茨海默病是一种中枢神经系统退行性变性疾病。患者由于神经细胞的大量死亡而逐渐出现记忆能力、语言能力和直觉能力的全面下降，最终会因脑衰竭而死亡。阿尔茨海默病最具有特异性的病理特征的是老年斑、神经纤维缠结，以及神经突触和神经细胞的丢失。而脑组织内老年斑的形成是造成阿尔茨海默病的主要原因，而且在阿尔茨海默病的早期出现。 老年斑的主要成分是39-43氨基酸长的β淀粉样肽（β-amyloid peptide，Aβ），Aβ由β淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）水解而来，APP可以被三种水解酶裂解：α-secretase、β-secretase、γ-secretase。Α-secretase的水解位点在APP跨膜区的Aβ区内，产生一长的可溶性的胞外结构α-APPs和一83碱基的C末端（COOH-terminal fragment，CTF）--C83，不产生Aβ。而淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）经β淀粉样前体蛋白裂解酶（β-siteAPP cleaving enzyme，BACE1）和γ-分泌酶裂解产生Aβ。淀粉级联学说认为老年斑的核心成分β-淀粉样肽（β-amyloid peptide，Aβ）是AD发生的主要原因。BACE1（β-secretase）酶是Aβ形成的关键酶。 老年斑或Aβ可以促进AD的疾病进展，而且是AD临床表现的关键性因素。Aβ具有神经毒性作用，当Aβ在脑组织中沉积超过一定的时间后，就可以造成神经细胞的死亡、脑内的炎症性反应、以及其他的可以促进AD病情进展的有害的病理改变。而且，大量的研究显示，Aβ在AD患者疾病的早期即出现。 小干扰RNA（siRNA）可谓是引起生物科学研究领域一场变革的工具，siRNA是一种特异性抑制特定基因的有力手段。RNAi不但可以用来快速的判断基因的功能，而且目前已经在病毒感染、肿瘤和遗传性疾病中进行了大量的研究，并取得了良好的效果。 减少Aβ的生成成为治疗AD的主要靶位点。目前唯一得到FAD许可的治疗药物只有乙酰胆碱酯酶抑制剂（如tacrine，donepezil，rivastigmine，galantamine），而其他的药物治疗正在研究进行中，这些包括：单胺氧化酶抑制剂（如selegiline），抗氧化剂（如Vit E、C），雌激素替代疗法和抗炎制剂（如非甾体类抗炎药物），大多数的治疗均为姑息性治疗，而非预防或治愈性手段。目前减少Aβ产生的有许多方法，在本实验中我们选择了抑制BACE1基因作为研究的靶基因，通过抑制此该基因的表达来减少Aβ的生成。我们利用干扰技术应用siRNA对BACE1基因进行干扰抑制，观察BACE1基因在SK-N-SH细胞株中的表达的改变，以及Aβ产生的改变情况。 研究目的: 1、利用siRNA干扰技术，采用化学合成的siRNA干扰或封闭BACE1基因，观察BACE1的表达改变。 2、进一步观察BACE1基因的表达下降后，对体外培养的神经细胞Aβ产生的影响。 实验方法: 1、人类的神经母细胞瘤细胞SK-N-SH细胞正常情况下，表达APP和BACE1，我们利用SK-N-SH细胞作为体外研究的细胞系。 2、我们利用Ambion公司的Silencer（）pre-designed siRAN Specification system设计合成了3对BACE1基因双链siRNA。3对siRNAs特异性的针对BACE1基因。 3、利用Ambion公司的siPORT NeoFX转染试剂转染siRNA入SK-N-SH细胞。为比较、观察siRNA对BACE1基因的干扰作用，分别使用了10uM-50uM浓度不等的siRNA转染SK-N-SH细胞，并且分别从12-48小时搜集细胞，进行检测。 4、应用RT-PCR在的mRNA水平上检测BACE1基因的表达。 5、应用Western blot方法，检测转染48小时后的神经细胞的BACE1蛋白表达。 6、应用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测分泌到细胞外的Aβ42的量。转染后6小时将siPORT NeoFX转染试剂换成MEM细胞培养液继续培养SK-N-SH细胞，并且每6-12小时收集培养液上清用于检测Aβ42。 结果: 1、设计合成特异性的siRNAs 我们利用Ambion公司的Silencer（）pre-designed siRAN Specification system设计合成了3对BACE1基因双链siRNA。3对siRNAs特异性的针对BACE1基因。 2、siRNA转染SK-N-SH细胞株传代细胞： 通过对3对siRNA1、siRNA2、siRNA3从不同的工作浓度和不同的转染后时间进行了观察，我们发现40nM和50nM时转染效率比较高，而且siRNA1和siRNA2对BACE1基因的抑制效应比较好。36小时和48小时的时间点siRNA的封闭效果比较好。 3、RT-PCR结果： 经过对同一标本的β-actin的产物积分光密度校正目的基因的积分光密度值，并按公式相对值=目的基因表达强度/β-actin表达强度，计算出目的基因表达的相对值，我们可以看出siRNA对BACE1基因的封闭效应达到了50％以上，实验组SK-N-SH细胞的基因抑制效果与对照组比较，具有统计学的显著性差异。 4、Western blot杂交结果： 利用NIH成像系统对Western blot成像的信号强度进行量化分析，并与β-actin相比较，β-secretase酶的表达有明显的下降，与对照组比较有显著性差异。 5、ELISA方法检测结果： ELISA检测显示，处理以siRNA1、siRNA2的SK-N-SH细胞分泌到细胞外的Aβ42较对照组有明显的减少。但是siRNA3干扰组的细胞所产生的Aβ42虽然也有减少，但是与对照组比较无显著性差异。 结论: 1，利用siRNA干扰技术可以有效地干预神经细胞内源性的BACE1表达下降，此种抑制作用表现在mRNA和蛋白水平。 2、SK-N-SH细胞内的BACE1基因表达的降低，直接导致了细胞产生并分泌到细胞外Aβ42减少。 改变BACE1基因的表达，可以有效的抑制Aβ42的产生，BACE1基因可以作为AD治疗的靶基因。 意义: Aβ的过度生成以及在神经细胞内的沉积，是AD患者脑内的特征性的病理改变，也是促进AD疾病发展的关键因素。因此本研究的意义所在： siRNA可以在体外可以干预BACE1表达，β-secretase酶的活性的降低致使Aβ减少。为我们今后AD针对β-secretase酶和Aβ治疗的治疗靶点，提供了有力的理论依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语中英文对照

声明

第一部分：运用RNA干扰技术抑制β-淀粉样前体蛋白裂解酶活性

前 言

材料与方法

结 果

附 图

讨 论

第一部分小结

参考文献：

第二部分：体外抑制BACE1(β-secretase)表达减少神经细胞Aβ的产生

前 言

材料与方法

结 果

附 图

讨 论

第二部分小结

参考文献：

总 结

致 谢

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