免疫治疗对原因不明习惯性流产Tim-1与Tim-3表达的影响

摘要

目的： 对原因不明习惯性流产（Unexplained Recurrent Spontaneous Abortion，URSA）患者进行皮内注射丈夫淋巴细胞（Paternal Lymphocyte Immunization）主动免疫治疗。通过荧光定量RT-PCR方法检测治疗前后外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs）中Tim-1与Tim-3mRNA的表达水平；通过补体依赖的微量混合淋巴细胞毒（complement-dependent micro mixed lymphocyte cytotoxicity，CDC）实验，检测患者血清中的抗夫淋巴细胞抗体（Anti-paternal lymphocyte antibody， APLA）。评价免疫治疗效果，探讨Tim-1，Tim-3及APLA在URSA及主动免疫治疗中的作用。 方法： 1．研究对象 35例临床诊断为URSA的患者，年龄23-34岁，流产次数2-5次。25例无不良妊娠史健康中期妊娠妇女，年龄23-31岁。 2．主动免疫治疗 无菌抽取患者丈夫静脉血20ml，采用Ficoll密度梯度离心法无菌分离PBMCs，于患者前臂皮内注射，每21天进行一次同样的免疫注射，共4次。第三次注射结束后患者方可计划受孕，随访再次妊娠结局。 3．PBMCs中Tim-1与Tim-3 mRNA表达 从NCBI数据库获得人β-actin（ACTB），Tim-1（T/M-1）及Tim-3（TIM-3）的cDNA序列，根据引物设计原则，应用Premier Primer5．0引物设计软件设计特异性引物，采用荧光定量RT-PCR方法，根据SYBR Premix EX Taq（Perfect Real Time）试剂盒说明，分别检测对照组PBMCs中β-actin，Tim-1和Tim-3 mRNA的相对表达水平；在治疗前及第4次治疗结束后第15天时检测患者PBMCs中β-actin，Tim-1和Tim-3mRNA的相对表达水平。 4．APLA 采用补体依赖的微量混合淋巴细胞毒（CDC）实验，分别检测对照组妻子血清对其丈夫淋巴细胞、患者治疗前和第4次治疗结束后第15天时妻子血清对其丈夫淋巴细胞的反应。 结果： 1．妊娠结局随访 35例患者中，4例在免疫治疗后随访期间未按计划受孕，31例按期受孕，其中28例安全度过孕早期，成功维持妊娠，3例再次发生早期自然流产。25例中期妊娠对照均正常分娩。 2．Tim-1和Tim-3 mRNA表达 利用最低循环数值（Ct）比较法检测目的基因的相对表达，结果表明URSA患者在治疗前Tim-1和Tim-3表达均明显高于正常对照（Tim-3，1．22±0．13 vs1．28±0．06，P<0．05；Tim-1，1．25±0．07 vs1．34±0．09 P<0．05）；免疫治疗后成功维持妊娠的28例URSA患者、未受孕的4例患者治疗后Tim-1和Tim-3的表达水平与治疗前相比，明显下调（P<0．05）；再次发生早期流产的3例患者治疗前后相比，Tim-1和Tim-3的表达水平无明显变化（P>0．05）。 3．APLA检测结果 主动免疫治疗前必须常规对患者进行APLA检测，阴性者方可接受治疗。纳入治疗对象的35例患者，治疗前APLA均为阴性，第4次免疫注射后第15天，有13例产生了APLA，其中12例成功维持妊娠，1例此疗程未按计划受孕。3例再次发生早期自然流产的患者，均未产生APLA抗体。25例对照组中，3例APLA阳性。 结论： 1．皮内注射丈夫淋巴细胞主动免疫治疗对一部分URSA患者产生了较满意的治疗效果（28/35，有效率80％）。 2．Tim-1和Tim-3可能参与免疫治疗。 3．URSA患者体内Th细胞免疫应答水平较高，机体处于免疫应答活跃状态，免疫治疗后大部分患者Th细胞免疫应答水平降低，有利于建立和维持对胚胎的免疫耐受。 4．PBMCs中Tim-1和Tim-3 mRNA表达是一种可行的辅助检测指标，对于免疫治疗效果，指导免疫治疗方案及患者治疗后的受孕时机有一定的意义。 5．主动免疫治疗后一部分患者产生了APLA，这种抗体对胚胎可能具有保护作用，但未产生APLA抗体尚不能认为免疫治疗预期效果不佳。

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结果

讨论

结论

参考文献

综述1 原因不明习惯性流产的免疫学病因研究进展

综述2 原因不明习惯性流产及其免疫治疗的研究进展

附图

致谢

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