胎粪吸入诱导新生大鼠急性肺损伤信号通路及西地那非作用的研究

摘要

本文主要从以下三部分进行论述:
　　第一部分 直视下经口气管插管建立新生大鼠胎粪吸入急性肺损伤模型
　　第二部分 西地那非对胎粪吸入诱导新生大鼠急性肺损伤保护作用的研究
　　第三部分 胎粪吸入诱导新生大鼠急性肺损伤信号通路及西地那非作用的研究
　　方法：
　　第一部分
　　48只健康雄性新生Wistar大鼠，日龄14～21天，随机分为气管切开组（A组）18只、直视下气管插管组（B组）24只、正常对照组（C组）6只;B组分为生理盐水对照组（BN组）、低浓度胎粪组（BL组）、中浓度胎粪组（BM组）、高浓度胎粪组（BH组），每组6只。A、B组大鼠苯巴比妥钠腹腔麻醉，A组气管切开，插管后呼吸机辅助呼吸;B组直视下经口气管插管，1分钟拔管，自主呼吸。
　　第二部分
　　24只新生健康雄性western大鼠，日龄14～21天，随机分为生理盐水对照组(C组)、胎粪吸入组（M组）、地塞米松组（D组）、西地那非组（S组），直视下气管插管，气管内注液2ml/kg，C组注入生理盐水，其余三组注入胎粪，浓度为60mg/L。
　　第三部分
　　48新生健康雄性western大鼠，日龄14～21天，随机分为8组，生理盐水对照组（C组）、胎粪吸入组（M组）、西地那非组（S组），ERK抑制剂组(PD组)、P38抑制剂组（SB组）、JNK抑制剂组（SP组）、PI3K抑制剂组（W组），因各组抑制剂均用二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，故设立溶剂对照组DMSO组（D组）。各组予腹腔注射，剂量5ml/kg，C组、M组、S组为磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution，PBS）;其余组用PBS稀释试剂至相应浓度。
　　结果：
　　第一部分
　　1、建模成功率
　　A组18只大鼠中，3只(3/18)成活到气管插管后6小时，建模成功率16.67％。B组22只(22/24)建模成功，成功率91.67％。BH组死亡2只。两组建模成功率比较X=24.01，差异有统计学意义(p＜0.01)。
　　2、肺组织湿/干重比
　　各组大鼠肺组织湿/干重比差异有统计学意义(F=24.48，P＜0.01)。与C组相比，BN组略高，但差异无统计学意义（P＞0.05）;然后由低至高依次为BL组、BM组、A组，BH组，组间差异有统计学意义(P＜0.05);BH组最高，但与A组差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　3、病理结果
　　各组大鼠肺组织病理评分差异有统计学意义（F=51.31，P＜0.01）。C组最低，然后是BN组，但两组差异无统计学意义(P＞0.05); BL组、BM组均高于BN组(P＜0.05)，BM组高于BL组(P＜0.01)，低于BH组及A组(P＜0.05)，差异均有统计学意义;A组最高，但与BH组差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　第二部分
　　1、病理评分
　　各组间病理评分差异有统计学意义(F=14.46，P＜0.01)。M组最高，高于D组、S组(P＜0.05)，C组(P＜0.01)，D组、S组高于C组(P＜0.01)。
　　2、氧化应激及炎症因子
　　M组MPO、NO、MDA浓度最高，高于D组、S组、C组(P＜0.01)，D组、S组高于C组(P＜0.01)。M组SOD浓度最低，低于C组、D组、S组(P＜0.01)，C组低于D组、S组(P＜0.01)。
　　3、细胞凋亡
　　M组凋亡指数（TUNEL法）、Bax蛋白和基因的表达最高，高于C组、D组、S组(P＜0.01)，D组、S组高于C组(P＜0.01);C组Bcl-2/Bax蛋白和基因、Bcl-2蛋白和基因的表达最低，低于M组、D组、S组(P＜0.01)，M组低于D组、S组(P＜0.01);D、S两组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　4、血清cAMP、cGMP浓度
　　D组cAMP最高，高于S组、M组、C组(P＜0.01)，S组高于M组(P＜0.05)、C组(P＜0.01)，M组高于C组(P＜0.05);S组cGMP最高，D组高于M组及C组(P＜0.01)，M组、C组差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　第三部分
　　1、病理评分
　　SB组、SP组和S组炎症表现较轻，M组、D组、W组及PD组炎症表现较重。各组间病理评分差异有统计学意义(F=28.23，P＜0.01)。
　　2、血清TNF-a浓度检测
　　各组间差异有统计学意义(F=31.87，P＜0.01)。SB组、SP组、S组较C组升高(P＜0.01)，较M组降低(P＜0.01)，三组之间差异无统计学意义;PD组和W组较M组升高(P＜0.05)，两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　3、肺组织中p-P38、p-ERK1/2、p-JNK及p-Akt蛋白的表达
　　3.1 p-P38蛋白的表达
　　免疫组化法检测显示，胎粪刺激后M组可见p-P38阳性细胞增多，尤其在浸润的中性粒细胞中多见。给予P38抑制剂及西地那非后，均可见p-P38阳性细胞减少。Western blot检测显示，组间差异有统计学意义(F=48.28，P＜0.01)。SB组和S组较C组升高（P＜0.01），较M组、D组降低(P＜0.01)，SB组和S组之间差异无统计学意义。
　　3.2 p-ERK1/2蛋白的表达
　　正常对照组可见少量阳性细胞，胎粪刺激后，M组、D组呈阳性表达，主要为中性粒细胞、血管内皮细胞等，在细胞浆及细胞核内可见棕黄色颗粒沉积。ERK1/2抑制剂干预后，p-ERK1/2蛋白表达明显减少;西地那非干预后，p-ERK1/2蛋白呈强阳性表达。Western blot检测显示，各组间差异有统计学意义(F=124.28，p＜0.01)。PD组与C组差异无统计学意义(p＞0.05），低于M组、D组(p＜0.01）;S组高于M组及D组(p＜0.05)。
　　3.3 p-JNK蛋白的表达
　　免疫组化检测显示，西地那非及JNK抑制剂干预后，肺组织内p-JNK表达很弱，与C组相似，M组、D组可见阳性表达，表现为细胞浆内及部分细胞核内棕黄色。Western blot检测显示，组间差异有统计学意义(F=119.96，p＜0.01)。C组、SP组、S组肺组织p-JNK表达差异无统计学意义(p＞0.05)，均低于M组、D组(p＜0.01)。
　　3.4 p-Akt蛋白的表达
　　免疫组化结果显示，C组及PI3K抑制剂作用后新生大鼠肺组织可见弱阳性表达，W组、D组呈阳性表达，给予西地那非后S组可见阳性表达明显，细胞内见棕黄色颗粒。Western blot检测显示，差异有统计学意义(F=57.26，p＜0.01)。C组和W组最低;S组高于M组、D组，差异有统计学意义(p＜0.01）。
　　结论：
　　1、传统的气管切开气管插管方法对新生大鼠组织损伤大，操作复杂，需要小动物呼吸机辅助呼吸，建模成功率低，并可导致应激性肺损伤，影响实验结果。我们通过直视下经口气管插管建立新生大鼠胎粪吸入模型，建模成功率高，无应激性肺损伤。同时确定浓度为60mg/ml的胎粪混悬液可导致新生大鼠肺组织典型而广泛的病理改变。
　　2、炎症因子、氧化应激损伤和细胞凋亡参与了胎粪吸入诱导新生大鼠急性肺损伤的发病机制;西地那非可抑制炎症因子的表达，减轻氧化应激损伤;增加Bcl-2的表达，减少Bax的表达，降低Bcl-2/Bax比值，从而抑制细胞凋亡，减轻MAS导致的ALI的病理损伤。西地那非可能通过增加cGMP和cAMP的活性发挥生物学效应。
　　3、MAPKs信号通路中的P38、ERK1/2、JNK及PI3K/Akt信号通路均参与了新生大鼠MAS诱导的ALI的病理过程。P38 MAPK通路和JNK MAPK通路可能通过增加炎症因子TNF-a的表达加重肺组织病理损伤，ERK1/2 MAPK通路和PI3K/Akt通路可减少TNF-a的表达从而减轻病理损伤。西地那非在MAS诱导新生大鼠ALI的动物模型中，可影响信号通路，抑制肺组织p-P38及p-JNK蛋白的表达，增加p-ERK1/2和p-Akt蛋白的表达，具有一定的肺保护作用。
　　创新及意义：
　　1、本研究通过直视下经口气管插管建立新生大鼠胎粪吸入模型，建模成功率高，无应激性肺损伤。同时确定浓度为60mg/ml的胎粪混悬液适宜用来建立新生大鼠MAS模型。
　　2、本研究明确西地那非通过减轻氧化应激、减少炎症因子的表达，抑制细胞凋亡等对MAS诱导新生大鼠ALI具有肺保护作用，为临床使用西地那非治疗ALI提供理论依据。
　　3、本研究明确了MAPKs(P38、JNK、ERK1/2)及PI3K/Akt信号通路均参与了新生大鼠MAS诱导的ALI的病理过程，P38 MAPK通路和JNK MAPK通路可增加炎症因子TNF-a的表达加重肺损伤，ERK1/2 MAPK通路和PI3K/Akt通路可减少TNF-a的表达从而减轻病理损伤。西地那非可抑制肺组织p-P38及p-JNK蛋白的表达，增加p-ERK和p-Akt蛋白的表达，具有一定的肺保护作用。选择性的信号通路抑制剂有望成为临床治疗的新方向。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 直视下经口气管插管建立新生大鼠胎粪吸入急性肺损伤模型

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 西地那非对新生大鼠胎粪吸入诱导急性肺损伤保护作用的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 胎粪吸入诱导新生大鼠急性肺损伤信号通路及西地那非作用的研究

前言

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

结论

附图

文献综述 胎粪吸入诱导急性肺损伤细胞因子的表达和细胞凋亡

致谢

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