包含sLex的肿瘤糖疫苗的可行性评价与sLex衍生物(sLex-方酸乙酯)的活性研究

摘要

恶性肿瘤是我国居民死亡的主要原因之一，近20年来，研究者逐渐将研究重点放在肿瘤特异性免疫治疗上，即通过肿瘤疫苗来治疗肿瘤，并在这方面取得了一些进展，免疫疗法应该是目前对人体毒性伤害最小的疗法。免疫治疗主要通过两种途径抑制肿瘤:一种是在肿瘤发生过程中诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫应答;另一种是对肿瘤进行长期监控，降低肿瘤复发的可能性，这可以通过免疫记忆实现。现在已有一些肿瘤疫苗上市，可以预见在将来，人们很有可能能通过疫苗来预防治疗肿瘤。
　　肿瘤相关糖抗原(TACAs)是指在正常细胞与肿瘤细胞上都存在，但在表达量上有很大差异的糖抗原，它与肿瘤的转移和侵袭都有关系。唾液酸化Lewis x(sialyl Lewis x，sLex)是E、P和L-选择素这三种粘附分子的配基，多表达在胚胎组织及肿瘤细胞表面，在免疫细胞上也有少量的表达。研究表明，sLex在一些恶性上皮性肿瘤的浸润、转移过程中发挥重要作用。所以sLex是一种设计肿瘤疫苗的合适靶标，但是sLex属于TACAs，而TACAs不能引起T细胞的免疫应答，导致它并不能产生高亲和力的IgG抗体，也不能产生记忆细胞，且容易引起免疫耐受。将TACAs与蛋白载体相连接的方法可以用来提升免疫原性，使糖抗原可以被T细胞识别，引起T细胞的免疫应答。
　　CRM197蛋白是白喉毒素(diphtheria toxin，DTx)突变体，它没有白喉毒素的毒性，但保留了与白喉毒素相同的炎症性和免疫刺激性，这使它被广泛应用作糖结合物疫苗载体。钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)来自于海洋蜗牛的血淋巴，也被广泛应用为载体蛋白，首先对比其他载体蛋白KLH能引出更强的免疫应答，这是由于其相对分子质量(Mr)大、结构较复杂造成的，其次由于KLH来源于海洋蜗牛，它在生物系统上远离哺乳动物物种，因此在测定过程中产生与哺乳动物待检测靶点样品发生交叉反应的抗体的可能性较小。
　　本课题将sLex与重组的CRM197蛋白或KLH蛋白相连接，合成了CRM197-sLex和KLH-sLex结合物疫苗，并对其进行了免疫学评价。同时，对与蛋白载体连接的sLex衍生物——sLex-方酸乙酯的活性进行了研究。主要研究内容与结果如下。
　　第一部分
　　1.CRM197蛋白的表达和纯化
　　目的蛋白CRM197在大肠杆菌中除了以包涵体的形式大量表达，也以可溶的形式少量表达。鉴于实验用量、纯化的简便性以及纯化蛋白的稳定性考虑，主要纯化了可溶性表达的CRM197，在20℃、0.5mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导条件下，每1L菌液获得纯化的CRM1977.5mg。
　　2.糖蛋白结合物疫苗的合成及其合成效率测定
　　以方酸二乙酯活化sLex，将sLex糖链与CRM197蛋白、KLH蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)进行偶联，得到的糖结合物疫苗用MALDI-TOF-MASS或硫酸一苯酚法进行分析。经计算，平均一分子CRM197的载糖率约为4％;平均一分子KLH的载糖率约为7％;平均一分子BSA的载糖率约为3％;平均一分子HSA的载糖率约为10.8％。
　　3.糖蛋白结合物疫苗的免疫学评价
　　将合成的CRM197-sLex和KLH-sLex结合物作为疫苗对C57BL/6小鼠进行四次免疫并取得抗血清，抗血清用直接ELISA法进行抗体滴度(IgG)的分析。抗体滴度分析中，CRM197-sLex结合物免疫的抗血清可以产生更高的抗体滴度(1∶72900)，KLH-sLex结合物免疫的抗血清产生的抗体滴度为1∶24300。
　　用MTT法测定抗血清的补体依赖性细胞毒性作用(CDC)。用结合物疫苗免疫的小鼠产生的抗血清在补体存在的情况下，以剂量依赖型的方式对人肺癌A549细胞和鼠黑色素瘤B16-F10细胞产生较强的杀伤作用，B16-F10细胞与2μL抗血清共孵育存活率约为40％，A549细胞与2μL抗血清共孵育存活率约为60％。
　　通过划横实验测定抗血清对肿瘤迁移的影响,在36和48h时抗血清对A549细胞的迁移有显著的抑制作用。
　　通过体内抗肿瘤实验验证了KLH-sLex结合物对肿瘤的抑制率和存活率的影响都强于PBS组，但均不如KLH组，猜想有可能是sLexProSQ的体内活性对肿瘤抑制率和小鼠存活率造成了影响。
　　第二部分
　　1.SLexProSQ的细胞毒性测定
　　用MTT法测定不同浓度sLexProSQ对EA.hy926细胞、B16-F10细胞、A549细胞在不同时间点的存活率的影响。结果显示，sLexProSQ在各个浓度(0.1、0.2、0.5、1、2、4、6、8、10μg/mL)以及所有检测时间点（6、12及24h）都对细胞存活率没有明显的影响。
　　2.SLexProSQ抗E-选择素粘附效应
　　用MTT法测定不同浓度sLexProSQ与B16-F10细胞、A549细胞共孵育对E-选择素粘附效应的影响。结果显示，sLexProSQ在800μg/mL的浓度下对细胞与选择素的粘附有显著的抑制效果。
　　3.SLexProSQ体内抗肿瘤实验研究
　　SLexProSQ高中低三个剂量均对小鼠B16-F10黑色素瘤有一定的抑制作用，低剂量组抑制率平均为13％、中剂量组抑制率平均为59.7％、高剂量组抑制率平均为27.4％。
　　HE染色观察组织坏死情况，给药组坏死均强于PBS组，PBS组肿瘤细胞的异型性较给药组更为严重。
　　CD34免疫组化结果表明给药组肿瘤组织新血管生成少于PBS组，且中剂量组新血管生成最少。与Western blot做VEGFR-2条带显示结果一致。
　　用ELISA法测定sLexProSQ不同剂量对IL-6、TNF-α和IL-1β含量的影响，随着给药剂量的升高IL-6的含量降低，TNF-α和IL-1β的含量升高。
　　结论：
　　本研究成功合成了CRM197-sLex和KLH-sLex结合物疫苗，并对其进行了免疫学评价。C57BL/6小鼠可以在结合物疫苗的刺激下产生较高的抗体滴度，其抗血清在体外有补体存在的情况下可以杀伤表达该抗原的肿瘤细胞，并能在体外抑制表达该抗原的肿瘤迁移，但在体内并未产生良好的抗肿瘤效果。
　　通过对sLex衍生物的活性进行研究，体外研究发现sLexProSQ具有抑制肿瘤细胞对E-选择素的粘附，体内研究发现sLexProSQ在一定剂量下对肿瘤具有明显的抑制作用。
　　本研究为基于sLex的糖疫苗的设计和研究提供了基础，也为sLex及其衍生物作为抗肿瘤制剂的开发提供了实验依据。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1 肿瘤免疫治疗

2 肿瘤相关糖抗原

3 肿瘤相关糖疫苗

4 唾液酸化Lewis x作为肿瘤疫苗的靶标

5 CRM197和KLH作为肿瘤疫苗免疫载体

6 本课题的研究内容与意义

第二章 包含sLex肿瘤糖疫苗的制备与评价

1 材料

1．1 试剂

1．2 溶液配制

1．3 其他主要材料和动物

1．4 主要仪器设备

2 方法

2．1 SLex-方酸乙酯的制备

2．2 重组CRM197蛋白的表达

2．3 SLexProSQ与CRM197、HSA、KLH及BSA的共价结合

2．4 CRM197-sLex和KLH-sLex免疫小鼠及抗体滴度的检测

2．5 补体依赖的细胞毒性实验

2．6 抗血清对肿瘤细胞迁移的影响试验

2．7 疫苗体内肿瘤抑制实验

3 结果

3．3 SLexProSQ与CRM197、HSA、KLH及BSA的共价结合的载糖率测定

3．4 CRM197-sLex和KLH-sLex免疫小鼠血清sLex抗体滴度

3．5 补体依赖的细胞毒性实验

3．6 抗血清对肿瘤细胞迁移的抑制作用

3．7 疫苗体内肿瘤抑制实验

4．讨论

4．2 载糖率的测定

4．3 CRM197-sLex和KLH-sLex免疫小鼠血清sLex抗体滴度的检测

4．4 补体依赖的细胞毒性实验

4．5 抗血清对肿瘤细胞迁移的抑制作用

4．6 疫苗体内肿瘤抑制实验

第三章 唾液酸化Lewis x衍生物(sLex-方酸乙酯)对肿瘤的影响

1 材料

1．1 试剂

1．2 溶液配制

1．3 其他主要材料

1．4 主要仪器设备

2．方法

2．2 SLexProSQ抗E-选择素粘附效应测定

2．3 SLexProSQ体内抗肿瘤实验研究

3．结果

3．1 SLexProSQ的细胞毒性

3．2 SLexProSQ抗E-选择素粘附效应

3．3 SLexProSQ体内抗肿瘤实验研究

4．讨论

4．3 关于sLexProSQ对VEGFR-2表达的影响

4．4 关于sLexProSQ对肿瘤组织IL-6、TNF-α和IL-1β含量的影响

1 全文总结

2 创新点

3 展望

参考文献

致谢