雷帕霉素脂质体滴眼液对大鼠角膜新生血管抑制作用的实验研究

摘要

目的：制备雷帕霉素(RAPA)脂质体滴眼液，建立大鼠角膜碱烧伤动物模型，研究RAPA对大鼠角膜新生血管(corneal neovasc[1larization，CNV)的抑制作用及它对HIF-lQ及VEGF表达的影响，探讨RAPA抑制角膜新生血管的机理，并为通过抑制HIF-1Q阻断VEGF信号传导通路抑制角膜新生血管提供理论依据。 方法：利用薄膜分散法制备RAPA脂质体滴眼液，以正交设计法研究制备工艺中影响脂质体制备质量的主要影响因素，筛选出较理想的处方。将42只健康Wistar大鼠随机分为四组：A组正常对照组6只。B组碱烧伤空白对照组12只。C组碱烧伤空白脂质体对照组12只。D组碱烧伤RAPA脂质体治疗组12只。制备大鼠角膜碱烧伤动物模型，碱烧伤后： D组RAPA脂质体滴眼液滴眼，每天三次。C组空白脂质体滴眼液滴眼，每天三次。B组不予处理。另外各组氯霉素滴眼液预防感染，每天四次：每日裂隙灯观察眼局部情况，并详细记录碱烧伤后大鼠角膜反应情况及新生血管生长情况，并于碱烧伤后4d、7d、14d分别测量B、C、D三组角膜新生血管生长长度，计算生长面积。分别于碱烧伤后1d、4d、7d、14d随机抽取各组大鼠取材。免疫组织化学方法检测HIF-1Q及VEGF蛋白的表达，计算机图象分析，测定阳性细胞的光密度值：半定量逆转录聚合酶链反应(semi-qLlantitative reveFse。transcription p01ymerase chain reaction，RT-PCR)方法检测角膜组织HIF_lQmRNA及VEGF Mrna的表达，数字凝胶图象分析系统测定各条带光密度值(Q及VEGF分别与GAPDH的[DV比值作为HIF-Lq及VEGF表达水平的参数。 结果： 1．制得的RAPA脂质体，为完整的类球形，平均粒径为145.2nm，包封率为90.02％，RAPA脂质体滴眼液中RAPA含量高，粒径合适，可作为滴眼液用于动物实验。 2．碱烧伤后ld时仅见损伤区角膜上皮水肿，角巩膜缘周围充血水肿；碱烧伤后4d可见角巩膜缘处有角膜新生血管芽呈毛刷状向角膜中央生长。第7d时，CNV显著变长，面积增加。14d时新生血管交织呈网状，基本布满整个角膜。 3．RAPA治疗组与空白对照组及空白脂质体对照组相比CNV生长迟缓，稀疏，退化较早。CNV面积比较差异有显著性(PO.05)。 4．正常大鼠角膜上皮细胞有微弱的HIF-1 Q蛋白、VEGF蛋白的表达：碱烧伤后角膜上皮细胞、内皮细胞、炎症细胞，新形成的血管内皮细胞，F.1Q蛋白及VEGF蛋白表达均明显增强，4d时表达最强，7d时开始下降，14d已降至正常。RAPA治疗组HIF-1Q、VEGF的表达被显著抑制，与空白对照组及空白脂质体对照组相比差异有显著性(P<0.01)。 5．正常大鼠角膜有少量VEGFmRNA的表达，碱烧伤后表达增强，4d时表达最强，7d时开始下降，14d已降至正常。HIF-1 Q Mrna在正常角膜基本不表达，碱烧伤后有所增强，1d及4d时表达均高于正常，7d时已降至正常。RAPA治疗组HIF-1 Q Mrna、VEGFmRNAF的表达被显著抑制，与空白对照组及空白脂质体对照组相比差异有显著性(P

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

第一部分RAPA脂质体的制作

一仪器和材料

(一)仪器

(二)实验材料

二方法和结果

(一)RAPA脂质体的制备

(二)含量分析方法的建立

(三)精密度试验

(四)回收率实验

(五)脂质体包封率的测定方法

(六)质量评价

三结果

四讨论

(一)脂质体药物载体

(二)RAPA

五结论

第二部分RAPA滴眼液对大鼠角膜碱烧伤后形成的新生血管的作用

一材料与方法

(一)实验材料

(二)实验方法

二结果

(一)裂隙灯观察结果(CNV生长情况)

(二)HE染色结果

(三)免疫组化染色结果

(四)RT-PCR结果

三讨论

(一)角膜新生血管(CNV)形成机制

(二)HIF-1、VEGF与CNV的关系

(三)RAPA与CNV的关系

四结论

参考文献

附图

综述：缺氧诱导因子-1与新生血管

攻读学位期间的研究成果

致谢