雷帕霉素脂质体滴眼液对大鼠真菌性角膜炎治疗作用的实验研究

摘要

目的：制备雷帕霉素（rapamycin，RAPA，商品名Sirolimus）脂质体滴眼液，研究RAPA对大鼠真菌性角膜炎(fungal keratitis，FK)的治疗作用及它对单核细胞趋化蛋白-1(chemotactic protein-1，MCP-1)，白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)表达的影响，探讨RAPA治疗FK的机理，为临床真菌性角膜炎药物治疗提供思路及实验依据。
　　方法：利用薄膜分散法制备RAPA脂质体滴眼液，以正交设计法研究制备工艺中影响脂质体制备质量的主要影响因素，筛选出较理想的处方。将96只健康Wistar大鼠随机分为四组：A组正常对照组6只。B组真菌性角膜炎空白对照组30只。C组真菌性角膜炎空白脂质体对照组30只。D组真菌性角膜炎RAPA脂质体治疗组30只。A组大鼠不予处理；B、C、D组大鼠先制备FK动物模型，建模成功后：D组RAPA脂质体滴眼液滴眼，每天四次，C组空白脂质体滴眼液滴眼，每天四次，B组不予特殊处理。每日裂隙灯显微镜观察眼局部情况，并分别于建模后的1d、3d、5d、7d、14d详细记录真菌感染后大鼠角膜反应情况，评分并拍照；同时每个时间点随机抽取各组6只大鼠取材，HE染色及PAS染色行组织病理学检查；免疫组织化学方法检测MCP-1、IL-1β蛋白的表达，计算机图象分析，测定阳性细胞的光密度值;半定量逆转录聚合酶链反应(semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)方法检测角膜组织MCP-1、IL-1βmRNA的表达。
　　结果：1.制得的RAPA脂质体，为完整的类球形，平均粒径为145.2nm，包封率为90.02％，RAPA脂质体滴眼液中RAPA含量高，粒径合适，可作为滴眼液用于动物实验。2.裂隙灯显微镜检查可见：FK感染后1天，出现角膜水肿浑浊，3天，浑浊加重，蔓延至整个角膜，中央见溃疡灶，5天，溃疡加重，部分穿孔，7天，新生血管形成，开始瘢痕愈合。其中，RAPA治疗组角膜病变程度减轻，临床评分低于空白对照组及空白脂质体对照组。3.HE染色及PAS染色，HE染色显示：第1天角膜明显水肿，少量炎症细胞侵润，第3天，感染部位角膜结构完全被破坏，出现溃疡灶，大量的炎症细胞侵润；第5天，角膜组织变薄，基质纤维疏松，炎症细胞减少；第7天，纤维细胞增多，出现机化，少量炎症细胞侵润。PAS染色结果显示：感染后第1天，病灶可见少量菌丝；第3天，见大量的菌丝，第5天，病灶内可见少数几根菌丝或未找见菌丝；第7天则基本未查见菌丝。RAPA治疗组较空白对照组及空白脂质体对照组角膜病变程度轻，真菌数量减少。4.正常大鼠角膜上皮细胞有微弱的MCP-1、IL-1β蛋白的表达;FK感染后，MCP-1、IL-1β蛋白1d开始表达增强，3d时达高峰，5d开始下降，随后逐渐降低，14d略高于正常。RAPA治疗组MCP-1、IL-1β蛋白的表达被显著抑制，与FK对照组及FK空白脂质体对照组相比差异有显著性（P<0.01）。5.正常大鼠角膜上皮细胞有微弱的MCP-1、IL-1βmRNA的表达;FK感染后，MCP-1、IL-1βmRNA1d开始表达增强，3d时达高峰，5d开始下降，随后逐渐降低，14d略高于正常。RAPA治疗组MCP-1、IL-1βmRNA的表达被显著抑制，与FK对照组及FK空白脂质体对照组相比差异有显著性（P<0.01）。
　　结论：1.脂质体是RAPA良好的药物载体。
　　2.FK后角膜病变逐渐进展，5天达高峰，随后逐渐开始减轻，真菌负荷3天最重，随后逐渐减少。
　　3.正常角膜组织有少量MCP-1、IL-1β蛋白及mRNA的表达，FK后它们的表达增强，3d时达高峰，5d开始下降，随后逐渐降低，14d略高于正常。
　　4.RAPA对真菌性角膜炎有较好的治疗作用。
　　5.RAPA能减少真菌性角膜炎的真菌负荷。
　　6.RAPA能显著抑制MCP-1、IL-1β蛋白、MCP-1、IL-1βmRNA的表达。
　　7.RAPA可能是通过直接抑制真菌及抗炎、免疫调节作用来发挥对真菌性角膜炎治疗作用。

目录

引言

第一部分 RAPA脂质体的制作

一 仪器和材料

二 方法和结果

三 结果

四 讨论

五 结论

第二部分 RAPA滴眼液对大鼠真菌性角膜炎的作用

一 材料与方法

二 结 果

三 讨论

四 结论

参考文献

附图

综述：真菌性角膜炎的研究及药物治疗进展

致谢

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