腺病毒介导胰岛素样生长因子-1基因在Wistar大鼠体内表达时间的研究

摘要

【目的】
　　 观察腺病毒介导鼠胰岛素样生长因子-1（rlGF-1）基因在Wistar大鼠体内的表达时间；以及三种不同rIGF-1基因注射途径对其在体内表达效果的影响。
　　 【方法】
　　 复苏并培养293细胞，在293细胞中扩增腺病毒。4-5周龄Wistar雄性大鼠（体重150g±lOg）180只，随机分为对照组：①空白对照组，②腺病毒空载体（Ad-eGFP）对照组；实验组：⑨腹腔注射Ad-rIGF-1组，④肌肉注射Ad-rIGF-1组，⑤胰腺被膜下注射Ad-rIGF-1组，每组各36只。每组并随机分为6小组，小组编号为1-6，每小组6只。①空白对照组不做任何处理，②空载体对照组腹腔注射含Ad-eGFP的重组腺病毒液0.1ml，③④⑤组分别给予腹腔、肌肉、胰腺被膜下注射含Ad-rIGF-1的重组腺病毒液0.1ml。所有大鼠自由饮食。注射腺病毒后第3天、第7天、第14天、第21天、第28天，第35天依次处死编号1-6小组。处死大鼠后，立即取出胰腺，分为两部分，一部分中性福尔马林固定，石蜡包埋固定做免疫组化观察rIGF-1在胰腺局部含量；一部分-70℃冻存，做半定量RT-PCR，检测rIGF-I基因在胰腺局部表达情况。留取大鼠血液标本，离心取上清，测定血清IGF-1和胰岛素水平。每周检测第6小组大鼠体重和空腹血糖。
　　 【结果】
　　 腺病毒介导鼠胰岛素样生长因子-1基因在实验组有效表达，表达时间为腺病毒注射后第7天至第21天。ELISA法、免疫组化、逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）三种方法测得IGF-1在血液和胰腺局部升高情况一致，不同部位注射组无明显差别。ELISA法检测实验组血清胰岛素较对照组降低，但差异无统计学意义。实验组血糖较对照组无明显差别，体重较对照组增长明显。未观察到明显副作用。
　　 【结论】
　　 1．腺病毒介导鼠胰岛素样生长因子-1基因在Wistar大鼠体内有效表达，表达时间为注射基因后第7天至第21天。不同部位注射组之间无明显差别。
　　 2．腺病毒介导鼠胰岛素样生长因子-1基因在正常Wistar大鼠体内表达过程中，对胰岛素、血糖无明显影响，实验组体重增长较对照组明显。未见明显副作用。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一章 材料与方法

1.1 仪器、试剂、耗材

1.1.1 主要器材

1.1.2 主要试剂和耗材

1.1.3 常用试剂配置

1.1.4 实验动物

1.1.5 免疫组化实验试剂设备

1.1.6 ELISA实验设备

1.1.7 腺病毒载体基因

1.2 重组腺病毒的扩增及滴度测定

1.3 Wistar大鼠的分组及处理

1.4 血清rIGF-1和胰岛素测定

1.4.1 血清rIGF-1测定

1.4.2 血清胰岛素测定

1.5 胰腺免疫组化

1.5.1 石蜡包埋

1.5.2 切片、展片、粘片

1.5.3 免疫组化步骤

1.5.4 免疫组化SABC法观察IGF-1基因在胰岛的表达

1.6 RT-PCR步骤

1.6.1 提取胰腺RNA

1.6.2 纯度检测

1.6.3 RNA含量的计算

1.6.4 逆转录合成cDNA步骤

1.6.5 PCR扩增步骤

1.6.6 琼脂糖凝胶电泳

1.7 统计学处理

第二章 结果

2.1 重组腺病毒的扩增及滴度测定

2.2 大鼠IGF-1基因表达相关检测

2.2.1 大鼠血清IGF-1测定

2.2.2 胰腺IGF-1免疫组化

2.2.3 胰腺IGF-1基因RT—PCR

2.3 大鼠血清胰岛素测定

2.4 大鼠血糖检测

2.5 大鼠体重检测

2.6 副作用的观察

第三章 讨论

结论

参考文献

综述

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢