新城疫病毒地方分离株生物学特性的鉴定及疫苗候选株筛选的研究

摘要

本研究对自2000年以来从不同地区分离到的新城疫毒株中选取8株有代表性的毒株，经鸡胚终点稀释法克隆后，利用RT-PCR技术，成功地扩增出了8株NDV分离株F基因1629bp的核苷酸片段。利用DNAStar 6.0软件进行系统发育进化树的绘制，确定了基因型，并与参考毒株的核苷酸及相应氨基酸序列进行了比较。结果表明，其中6株分离毒株核苷酸同源率在97.4％～99.6％之间，与国内标准强毒株F<,48>E<,9>的核苷酸序列同源率为85.8％～89.3％；推导的氨基酸序列分析显示，这6株分离毒株氨基酸同源率在96.7％～99.3％之间；并且这6株分离毒株F蛋白的裂解位点氨基酸组成为<'112>R-R-Q-K-R-F<'117>，具有典型的强毒株裂解位点的特点：从进化树上看这6株分离毒株都属于Ⅶ型。另外，2株分离毒株核苷酸同源率为99.5％；氨基酸同源率是98.7％；并且这2株分离毒株F蛋白的裂解位点氨基酸组成为<'112>G-R-Q-G-R-L<'117>，具有典型的弱毒株裂解位点的特点，和LaSota的核苷酸同源率较高，分别为98.8％和99.2％；这2株分离毒株都属于基因Ⅱ型。 在以上生物学试验分析的基础上，将8株分离株及LaSota、Ⅰ系、Clone30、F<,48>E<,9>共12株NDV，进行交叉血凝抑制试验和交叉病毒中和试验。结果表明，毒株之间存在一定的抗原性差异。 综合8株分离株的基因型、生物学特性和交互免疫性，筛选出2株疫苗候选株，为HB38和F1。致病性试验表明，HB38的MDT为45.6h，ICPI为1.94，IVPI为2.98；F1的MDT为55.2h，ICPI为1.96，IVPI为2.79。这些指标都符合强毒株的标准。 对HB38和F1应用RT-PCR技术成功地克隆了HN基因，利用DNAStar 6.0软件进行系统发育进化树的绘制，并与参考毒株的核苷酸及相应氨基酸序列进行了比较。分析表明，HB38和Guangxi/2002同属于一个进化分支，氨基酸同源率为99.7％；F1和YN-PA01同属于一个进化分支，氨基酸同源率为98.1％；而HB38、F1与国内标准强毒株F<,48>E<,9>氨基酸的同源率分别为89.7％和88.8％。交叉免疫保护试验表明，HB38和F1对3种不同毒株攻击均可提供较好的保护。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1 NDV的生物学特性

1.1.1 NDV的结构及形态特性

1.1.2血凝特性(Hemagglutinin，HA)

1.1.3神经氨酸酶活性(Neuraminidase，NA)

1.1.4细胞融合与溶血活性

1.1.5抗肿瘤和抗衰老

1.1.6 NDV抗原性

1.1.7 NDV的复制

1.2 NDV基因组结构及其功能

1.2.1 NDV基因组结构

1.2.2 NDV结构蛋白及功能

1.3 NDV致病性的分子基础

1.4 ND的流行病学及分类

1.4.1 ND的流行病学

1.4.2 ND的一般分类

1.4.3 ND流行病学与基因分型

1.5 ND的免疫

1.5.1细胞免疫

1.5.2体液免疫

1.5.3局部免疫

1.5.4被动免疫

1.6 ND检测与诊断技术

1.6.1病毒的分离与鉴定

1.6.2血清学检测技术

1.6.3分子生物学诊断技术

1.7ND的防制

1.8本试验研究的目的及意义

2材料与方法

2.1毒株

2.2 SPF鸡和SPF鸡胚

2.3主要试剂和仪器

2.4病毒的克隆纯化

2.5 NDV分离株F基因的克隆

2.5.1引物设计与合成

2.5.2病毒RNA提取、反转录及PCR扩增

2.5.3 RT-PCR产物的回收

2.5.4回收产物连接

2.5.5 DH5α感受态细胞的制备

2.5.6连接产物转化

2.5.7含目的基因质粒的扩增

2.5.8重组质粒的提取与鉴定

2.5.9序列测定及分析

2.6分离株及LaSota、I系、Clone30、F48E9的交互免疫性的研究

2.6.1抗原的制备及甲醛灭活对血凝性的影响

2.6.2疫苗的制备

2.6.3高免血清的制备

2.6.4 1％红细胞悬液的制备

2.6.5各毒株相互之间交叉HI试验

2.6.6各毒株相互之间交叉病毒中和试验

2.7 NDV疫苗候选株的生物学特性

2.7.1鸡胚最小致死量的平均致死时间(MDT)的测定

2.7.2 1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)的测定

2.7.3 6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)的测定

2.7.4 NDV疫苗候选株HN基因的克隆

2.8 NDV疫苗候选株的免疫保护试验的研究

3结果

3.1 F基因的RT-PCR扩增结果

3.2重组质粒的酶切鉴定结果

3.3分离株F基因片段序列及同源性比较结果

3.4甲醛灭活对血凝性的影响结果

3.5各毒株相互之间交叉HI价测定结果

3.6各毒株相互之间的HI相关系数R的计算结果

3.7各毒株TCID50的测定值结果

3.8各毒株相互之间交叉病毒中和价(PD50)的测定结果

3.9各毒株相互之间的PD50相关系数R的计算结果

3.10 NDV疫苗候选株的MDT、ICPI和IVPI测定结果

3.11疫苗候选株HB38和F1的HN基因的RT-PCR扩增结果

3.12疫苗候选株HB38和F1的HN重组质粒的酶切鉴定结果

3.13疫苗候选株HB38和F1的HN基因片段序列及同源性比较结果

3.14 NDV疫苗候选株的免疫保护试验结果

4讨论

4.1 F基因生物学特性

4.2交互免疫性的研究

4.3疫苗候选株的生物学特性

4.4疫苗候选株的应用前景

5结论

致谢

参考文献

附录

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