新城疫病毒地方流行株的分离鉴定及生物学特性研究

摘要

新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的禽类高致病性、高度接触性传染病。NDV，又称禽I型副粘病毒（APMV-1），具有单股、负链、不分节的RNA基因组。NDV基因组长度约为15kb，由6个基因组成，依次为3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，其中F和HN基因与NDV致病性紧密相关。本研究对采集自湖北及周边省份的临床病料进行了NDV的分离鉴定及特性研究，对其F和HN基因进行了序列测定与遗传分析，以了解NDV的基因型和遗传变异特点。此外，完成2株NDV的全基因组序列测定，分别是鸽源NDV和鸭源NDV，有助于了解地方性新城疫的流行特点及新城疫防控。
　　本研究主要内容包括：⑴利用实时荧光RT-PCR方法对活禽市场和规模化养殖场采集的1382份样品进行病原的检测，然后再将阳性病料进行NDV的分离鉴定，共分离得到8株NDV。参考GenBank上公布的NDV F和HN基因序列，分别设计引物，通过普通RT-PCR方法对8株分离株的F和HN基因进行扩增，并测序。分析发现，5株分离株的F蛋白裂解区域氨基酸序列为112R-R-Q-K/R-R-F117，符合NDV强毒特征；其他3株相应区域序列为112 E/G-R/K-Q-E/G-R-L117，符合NDV弱毒特征。同时，发现F和HN基因的功能区和抗原位点均发生了氨基酸突变，这些突变可能会影响NDV的融合功能、抗体识别能力以及中和能力。运用MegAlign软件分别对F和HN基因全长进行遗传关系分析，结果表明，8株NDV分离株中，有3株基因VII型，2株基因I型，1株基因VI型、1株基因III型以及1株Class I类毒株。⑵利用鸡胚有限稀释法对8株病毒进行纯化，测定其血凝素活性的热稳定、鸡胚最小致死剂量的平均死亡时间、1日龄脑内接种致病指数等生物学特性。结果显示：8株NDV分离株纯化前后的HA效价并无明显差异。8株分离株中，5株毒株的血凝素对热不稳定，其他3株毒株的血凝素对热稳定。毒力测定结果显示，5株分离株的MDT和ICPI符合中等毒力或强毒特征，其他3株的MDT和ICPI符合弱毒特征，与F基因测序结果一致。同时，开展了强毒HB0901株感染鸡的病理剖检和组织病理学观察。接种12h后雏鸡表现出典型的新城疫症状，接种18h后出现雏鸡死亡现象。取病死雏鸡的肝、脾、肾、盲肠等组织制作石蜡切片，进行H.E.染色，可见典型的新城疫组织病理学变化，如脾淋巴细胞变性坏死、数量显著减少，肝细胞变性坏死，个别出现非化脓性脑炎。⑶利用普通RT-PCR方法对鸽源NDV HB1103株和鸭源NDV HN1007株进行全基因组序列扩增，通过DNAMAN软件对序列进行处理，获得了两株NDV分离株的全基因组序列。与基因组全长为15,186nt的HN1007株相比，基因组全长为15,192nt的HB1103株在NP基因的5'端非编码区内多出6个核苷酸。两株NDV毒株全基因组均由6个基因，1个引导序列，1个尾随序列，12个非编码区以及5个基因间隔区组成。根据上述两株毒株全基因核苷酸序列和其他5个基因编码区核苷酸序列绘制的遗传进化树与F基因遗传进化树结果一致，即HB1103株属于基因VIb亚型强毒株，HN1007株属于基因III型强毒株。HB1103株与HN1007株的全基因组同源性为86.0％。HN1007株与Mukteswar株高度同源，其核苷酸同源性大于99%。为了解HN1007株与Mukteswar株毒力差异的潜在关系，进一步对其核苷酸突变位点进行分析，发现全基因组只有23个核苷酸位点存在差异，共导致10个氨基酸突变。其中L基因上有13个核苷酸发生了变异，引起5个氨基酸突变。由于L蛋白与病毒的复制力和毒力等有关，因此推测分离株L蛋白上氨基酸突变是导致疫苗株Mukteswar株的毒力返强的主要因素。

目录

声明

缩略词表

文献综述

1 NDV一般生物学特性

2 NDV的分子生物学特性

3 NDV宿主的演变

4 NDV诊断技术

5 研究目的及意义

材料与方法

1 材料

2 试验方法

结果与分析

1 病原检测结果

2 病毒分离与鉴定结果

3 NDV 分离株F和HN基因序列分析

4 NDV分离株的部分生物学特性研究

5 HB1103株和HN1007株基因组序列的测定

讨论

1 NDV分离株的分离鉴定

2 NDV分离株F和HN蛋白的特征

3 NDV分离株生物学特性研究

4 两株NDV分离株的全基因组分析

5 PPMV-1对鸽和鸡的致病特点

6 水禽在NDV进化过程中的作用

结论

参考文献

附录一 实验中有关NDV毒株情况

附录二 攻读学位期间发表（待发表）论文情况

致谢