NF-κBp65在骨质疏松动物骨折愈合过程中的表达及siRNA对其表达影响的研究

摘要

目的：绝经后骨质疏松的发病率近年来逐渐上升，其主要发病机制是在雌激素缺乏的前提下，各种骨吸收刺激因子如TNF-α，RANKL，NF-κB等作用于成骨细胞(osteoblast，OB)和破骨细胞(osteoclest，OC)，导致成骨细胞活动减弱破骨细胞活动增强，同时抑制破骨细胞凋亡，从而导致骨丢失大于骨形成而发生骨质疏松。在此基础上发生的骨折的机率大大增加，骨折后愈合时间延长，愈合质量差更是目前研究的难题。 研究发现成骨细胞分泌的IL-1、IL-6，TNF-α是目前发现的强有力的骨吸收刺激因子，可直接促进破骨细胞前体细胞的有丝分裂及破骨祖细胞的分化，抑制破骨细胞凋亡，亦能激活NF-κB使其进入细胞核内，NF-κB激活后又能促进IL-1、IL-6，TNF-α等破骨细胞刺激因子的表达。由此可见，NF-κB在骨质疏松形成过程中起关键性作用。 那么骨质疏松骨折愈合时间长，质量差是否与NF-κB的调节相关，能否通过对NF-κB的调控来达到提高骨质疏松骨折愈合质量的目的，我们设计了去卵巢小鼠骨质疏松模型和桡骨远端骨折的骨折模型，测定其骨折愈合过程中局部骨微环境中核因子的表达水平，探讨其与骨质疏松骨折愈合的关系。 RNA干涉是1998年首次在秀丽线虫中发现并证明属于转录后水平的基因沉默机制。RNAi的发现改变了人们对细胞基因调控的传统理解，提供了特异性阻断基因表达的新策略。近些年，siRNA应用则是RNAi技术的最新进展，尤其是在特异性抑制哺乳动物细胞基因方面，既可以特异性抑制、降解同源mRNA序列，有效阻止相应蛋白质的表达，又可避免长链dsRNA引起的非特异性基因降解和细胞死亡，为哺乳动物细胞的基因治疗开创了新的道路、为以基于RNA的药物治疗人类疾病奠定了基础。本试验在体外应用NF-κBp65siRNA特异性阻断NF-κBp65基因在成骨细胞中表达取得成功的基础上，用NF-κBp65siRNA作用于骨折局部，探讨其在骨质疏松骨折愈合过程中的作用。 方法：1.动物分组、骨质疏松模型的复制和桡骨远端骨折模型的建立及siRNA的局部应用取4月龄同批成年雌性Balb/c小鼠80只，体重20-23g。①取4月龄同批成年雌性Balb/c小鼠40只，随机分成二组：假手术骨折模型组(SHAMFM组)：20只；去卵巢骨质疏松骨折模型组(OVXFM组)：20只。 ②取4月龄同批成年雌性Balb/c小鼠40只复制成去卵巢骨质疏松模型后随机分成二组：siRNA干涉骨折模型组：20只；错配siRNA干涉骨折模型组：20只。 各组动物去势后3个月建立桡骨远端骨折模型(假手术骨折模型组未切除卵巢)，后二组在骨折同时分别局部应用NF-κBP65siRNA及错配siRNA。 2.钼钯射线拍片、组织学观察和免疫组织化学染色及原位杂交检测在骨折模型建立后对上述动物行钼钯射线拍片，证实骨折模型建立成功。并在骨折后1、2、4、6周采用断头法处死，在无菌条件下及显微镜下切取右尺桡骨全长，行组织学观察和免疫组织化学染色及原位杂交检测。 3.结果判定、图像分析和统计学分析光镜下观察NF-κBp65蛋白和基因表达的定位与分布，定量结果经电脑图像分析获得。测定断端局部组织阳性细胞染色光密度值。所测数据用SPSS11.5ForWindows软件统计分析，小鼠NF-κBp65蛋白和基因含量表达用(x)±s表示，显著性差异用t检验进行组间差异比较，p＜0.05为有显著性差异。 结果：1.组织学观察骨折后1-2w，HE染色可见SHAMFM组骨折断端可见间充质细胞及早期的软骨性骨痂和新生毛细血管，原始骨小梁表面可见大量排列整齐的成骨细胞。OVXFM组软骨性骨痂生成较SHAMFM组少，且与SHAMFM组相比小梁较细少，小梁表面成骨细胞数亦少于SHAMFM组。骨折后4-6周，可见大量骨小梁生成，OVXFM组小梁较细少，排列紊乱。小梁状骨吸收快且被吸收数量多，小梁间距增宽。 2.免疫组织化学染色观察及结果NF-κBp65蛋白在骨折断端局部的表达主要位于新生幼稚软骨细胞、原始小梁周围的成骨细胞，破骨细胞及骨髓基质细胞中呈阳性。OVXFM组阳性表达明显强于SHAMFM组。(p＜0.05)。 3.原位杂交观察及检测结果去势组NF-κBp65mRNA的阳性表达，主要位于新生幼稚软骨细胞、新建骨小梁周边的成骨细胞，破骨细胞和骨髓基质细胞中，OVXFM组阳性细胞表达明显强于SHAMFM组(p＜0.05)。 4.siRNA干涉后原位杂交检测结果结果显示，给药后第一周siRNA干涉骨折模型组较错配siRNA干涉骨折模型组积分光密度值明显降低，(p＜0.05)，表明siRNA干涉骨折模型组局部组织中NF-κBp65的基因表达含量明显弱于错配siRNA干涉骨折模型组。从第二周开始，两组间没有明显差异，(p＞0.05)。 结论：骨质疏松动物骨折愈合过程中NF-κBp65在骨折局部的表达增强。siRNA对NF-κBp65基因表达可起到特异性阻断作用，可能对骨质疏松骨折愈合有促进作用。

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综述 实验性骨质疏松骨折愈合机理的研究进展

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