鲍曼不动杆菌耐药性及其泛耐株分子流行病学、耐药机制和治疗策略研究

摘要

不动杆菌属细菌是一类条件致病菌，广泛分布于自然界、医院环境和人体皮肤表面，如额头、耳朵、喉咙、腋下、手部、腹股沟、会阴、趾间都有不动杆菌。不动杆菌是引起医院感染的重要病原菌，主要引起医院获得性肺炎，尤其在免疫受损、气管切开、使用呼吸机病人中。在某些地方不动杆菌的感染甚至已超过了铜绿假单胞菌。近年来随着抗菌药物的不断研究和应用，不动杆菌属细菌对常用抗菌药物如β-内酰胺类，甚至碳青霉烯类药物的耐药性不断增加。目前大多数不动杆菌为多重耐药(Multi-drugResistantAcinetobacter，MDR-A)即同时对β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类耐药。不动杆菌感染有爆发流行的趋势。自从1991年在美国纽约第一次出现耐碳青霉烯的不动杆菌爆发流行以来，阿根廷、比利时、巴西、古巴、英国、法国、西班牙、新加坡、韩国、香港等地均有报道。我国此类研究不多，本文就沈阳地区鲍曼不动杆菌耐药性进行分析，同时对耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌的分子流行病学、耐药机制及体外联合药敏实验进行研究。 方法：标本来源于2001年1月～2003年12月中国医科大学附属一院所有住院及门诊患者的细菌学送检标本，同时收集中国医科大学2003年3月至2004年5月附属一院(12株)及二院(8株)临床分离的亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌20株，具体来源于附属一院ICU4株，呼吸病房5株，普外三病房1株，感染科病房1株，干诊1株，附属二院ICU8株，均为痰标本。细菌鉴定应用法国生物梅里埃公司API鉴定系统，药敏试验采用K-B纸片扩散法。采用E-test测定多种抗生素对亚胺培南耐药的20株鲍曼不动杆菌的M1C值，低熔点胶灌膜，蛋白酶K消化24小时，ApaⅠ37℃酶切10小时CHEFMAPPERTM电泳仪(美国BIO-RAD产品)电泳22小时，电泳条件：14℃，120°，6V/CM，5-22S剃度电泳，进行同源性分析，应用SPSS10.1统计学软件绘制菌株间关系的树状图。采用PhastSystem电泳仪测定等电点，三维试验法检测酶水解亚胺培南能力，采用Promegahighpureplasmidisolationkit质粒提取试剂盒提取质粒。供体菌为临床分离到的耐泰能鲍曼不动杆菌，受体菌为大肠杆菌C600，科玛嘉平板为筛选平板，进行接合实验。IMP、VIM、OXA型碳青霉烯酶及Ⅰ，Ⅱ类整合酶基因的PCR及序列分析扩增，PCR产物纯化后送上海生工测序，结果在GenBank网上查询。采用超声物理法制备外膜蛋白，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测外膜蛋白。评价多粘菌素B与利福平联合应用，采用棋盘法设计：将多粘菌素B和利福平以灭菌MH肉汤倍比稀释成11个浓度，分别为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0μg/ml。将配好的不同浓度的两种药物两两组合加入96孔平板中，37℃过夜培养。观察结果，记录单独应用两药的最低抑菌浓度MIC甲药单用和MIC乙药单用，并选择最佳组合效应时各自的MIC甲药联用和MIC乙联联用，FIC指数计算与判读：FIC指数=MIC甲药联用/MIC甲药单用+MIC乙联联用/MIC乙药单用。FIC指数≤0.5，协同作用；＞0.5～1，相加作用；＞1～2，无关作用；＞2,拮抗作用。 结果： 1、三年中鲍曼不动杆菌对所监测抗生素的耐药性有逐步升高的趋势。鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药率增加迅速，2001年为2.5％、2002年为5.6％，2003年迅速增为14.3％。ICU病房耐药率尤其严重，特别是亚胺培南耐药率高达35％。 2、20株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌均为泛耐药菌株，对多粘菌素B仍保持良好的敏感性(90％)，莫西沙星对约40％菌株的MIC在0.125μg/ml以下，对临床选择治疗亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌感染提供参考。PFGE示：20株菌株分为A(A1，A2，A3)，B(B1，B2)，C，D，E五个型，A1型9株，其中附属二院ICU5株，附属一院呼吸科3株，干诊1株；A2型1株，A3型1株，均来自附属一院呼吸科。这些菌株均出现于2004年4月-6月，其密集程度可以说是一次很大的暴发流行，并且两个医院间存在交叉传播。B1型4株，3株来自附属一院ICU科，一株来自普外3病房，均出现于2003年3月，说明存在医院内科室之间的传播。B2型2株，来自附属二院ICU，2003年8月菌株。C、D、E各一株，分别来自附属一院感染科、一院ICU和附属二院ICU。 3、20株均产生以下几种酶：pI5.4可被克拉维酸抑制(TEM-1)，pI6.7不被克拉维酸和邻氯西林抑制，pI＞9可被邻氯西林抑制(AmpC酶)。三维试验证实20株菌均产生能水解亚胺培南的β内酰胺酶，均不能被克拉维酸、氯唑西林、2-巯基丙酸抑制。未提出质粒。接合实验，科玛嘉平板上无蓝色菌落生长。采用1MP、V1M型、OXA-24特异引物扩增，20株菌均阴性；但用OXA-23特异引物扩增，20株菌均获得约1067bp片段的PCR产物，此产物包括编码OXA-23酶开放读码的全长序列，纯化后测序并与Genebank中公布的序列比较后发现，20株菌的PCR产物100％与OXA-23同源。所有20株菌均含Ⅰ类整合酶基因，但无Ⅱ类整合酶基因。外膜蛋白SDS-PAGE发现有四个克隆存在31KD条带处消失。 4、多粘菌素B与利福平联用后，多粘菌素B对亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌的MIC50由2μg/ml降至0.25μg/ml。利福平的MIC50由16μg/ml降至2μg/ml。FIC指数在0～0.5、0.5～1的百分率分别为55％、45％。 结论：三年中鲍曼不动杆菌对所监测抗生素的耐药性有逐步升高的趋势。碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌增多，但对多粘菌素B仍保持良好的敏感性(90％)，莫西沙星对约40％菌株的MIC在0.125μg/ml以下。碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌存在暴发流行，并且两个医院间存在交叉传播。产生OXA-23型酶是沈阳地区鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药的主要机制，碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌存在外膜蛋白的改变，可能为耐药机制之一。多粘菌素B与利福平联用，对亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌有良好的协同和相加作用。

目录

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中文论著摘要

英文论著摘要

英文缩略语

前 言

论文一 鲍曼不动杆菌耐药现状分析

论文二 亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌的分子流行病学的研究

论文三 碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌耐药机制的研究

论文四 多粘菌素B与利福平对亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌协同药物敏感性研究

参考文献

综 述 不动杆菌属细菌的耐药及其感染的控制和治疗

在学期间科研成绩

致 谢

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