肝细胞胆小管侧膜转运蛋白表达改变与胆色素结石形成的相关性实验研究

摘要

目的： 胆色素结石形成机制一直是国内外胆道疾病领域的研究热点，有研究表明胆汁成分的改变和胆道感染在胆色素结石形成中发挥了核心作用。以往的研究多是以感染胆汁为中心，通过检测胆汁、胆石成分，围绕Maki学说进行讨论，忽略了感染状态下可能导致肝细胞原发性分泌及原胆汁成分的改变。国内学者近些年来对胆色素结石的发病机理展开了广泛的研究，内容涉及免疫、微量元素、氧自由基、氨基酸含量、游离脂肪酸含量、金属元素在内的多方面研究，但尚无突破性进展。近半个世纪的研究证明，胆色素结石形成必须有三个必要条件和一个中心环节。必要条件是胆汁中游离胆色素增多、胆汁中钙离子增加及助溶因素减弱。中心环节是胆色素钙的沉淀与溶解平衡失调。胆汁的主要成分是胆固醇、胆汁酸和磷脂，它们都是经肝细胞胆小管侧膜分泌入胆汁。作为胆色素结石的关键成分胆色素也是通过肝细胞胆小管侧膜转运蛋白分泌入胆汁。目前关于肝细胞的原发性分泌状态改变导致胆汁成分改变在胆色素结石形成过程中作用的研究甚少。我们通过建立豚鼠胆色素结石模型，观察胆色素结石形成过程中肝细胞胆小管侧膜转运蛋白的表达改变，同时观察胆色素结石形成过程中胆汁主要成分的变化情况，进一步从肝脏原发性分泌状态探索胆色素结石形成的机制。另外采用液相色谱—质谱联用技术做胆汁代谢组学检测，将成石豚鼠胆汁与未成石豚鼠胆汁的代谢图谱进行对比研究分析，成石胆汁与未成石胆汁内代谢物得到分离，并将对二组分离做出贡献的代谢物进一步分析，初步鉴定在胆色素结石豚鼠胆汁中产生了较大差异的代谢物，推测其可能的分子式及结构，并探讨它们在胆色素结石形成过程中的作用。 实验方法： 一、实验对象 健康豚鼠45只，雌性23只，雄性22只，体质量210～250g，随机分为2组：(对照组/CON组15只，致石组/PS组30只)，适应性饲养一周后，分别给予普通饲料及致石饲料。致石周期为8周，饲养期结束后观察各指标。 二、标本采集 10％水合氯醛腹腔注射麻醉后采集豚鼠肝脏标本、胆囊胆汁标本、胆石标本，—80℃保存，另取部分肝脏标本保存在甲醛溶液中。 三、检测指标 1.致石率评定及红外光谱结石定性：解剖显露豚鼠胆囊，肉眼即可清晰辨别胆囊结石形成情况，采用红外光谱溴化钾压片法，对结石成分进行定性，统计结石形成率。 2.免疫组化方法研究肝细胞胆小管侧膜胆汁酸转运蛋白(Abcb11)：肝脏组织制作石蜡切片，免疫组化方法观察肝细胞胆小管侧膜Abcb11分布情况。 3.免疫组化方法研究肝细胞胆小管侧膜二价胆盐及结合胆色素转运蛋白(Abcc2)：方法同上。 4.免疫组化方法研究肝细胞胆小管侧膜磷脂转运蛋白(Abcb4)：方法同上。 5.Western Blot法研究肝细胞胆小管侧膜胆汁酸转运蛋白Abcb11转录后的改变：取肝脏组织标本，提取膜蛋白，SDS凝胶电泳，ECL化学发光法检测肝细胞胆小管侧膜胆汁酸转运蛋白在转录后水平的变化情况。 6.Western Blot法研究肝细胞胆小管侧膜二价胆盐及结合胆色素转运蛋白Abcc2转录后的改变：方法同上。 7.Western Blot法研究肝细胞胆小管侧膜磷脂转运蛋白Abcb4转录后的改变：方法同上。 8.RT-PCR法研究肝细胞胆小管侧膜胆汁酸转运蛋白Abcb11在mRNA水平上的改变：取肝组织标本，提取肝脏组织总RNA，扩增目的基因，观察肝细胞胆小管侧膜胆汁酸转运蛋白在mRNA水平的变化情况。 9.RT-PCR法研究肝细胞胆小管侧膜二价胆盐及结合胆色素转运蛋白Abcc2在mRNA水平上的改变：方法同上。 10. RT-PCR法研究肝脏胆小管侧膜胆固醇转运蛋白Abcg5及Abcg8在mRNA水平上的改变：方法同上。 11.胆汁生化学检测。 12.液质联用胆汁代谢组学研究：胆汁应用高效液相色谱分离后，行质谱分析。 实验结果： 一、豚鼠胆囊胆色素结石模型构建情况 对照组豚鼠成石率为14.29％，致石组豚鼠成石率为68.24％，明显高于对照组。结石含有胆色素和胆固醇成分，并以胆色素成分为主。 二、豚鼠肝细胞胆小管侧膜转运蛋白的表达变化 1、免疫组化结果显示豚鼠肝细胞胆小管侧膜上有棕色颗粒分布，提示肝细胞胆小管侧膜有相应蛋白表达。与对照组豚鼠相比，致石组肝细胞Abcb11(t=5.589，P<0.01)、Abcc2(t=5.468，P<0.01)表达下降，着色少；Abcb4表达略有上升，但无统计学意义。致石组中与未成石豚鼠相比，成石豚鼠肝细胞Abcb11(t=8.620，P<0.01)、Abcc2(t=7.786，P<0.01)表达下降明显。 2、Western Blot结果显示，与对照组相比，致石组豚鼠肝细胞胆小管侧膜转运蛋白Abcb11(t=8.412，P<0.01)、Abcc2(t=7.894，P<0.01)表达量下降：致石组中成石豚鼠与未成石豚鼠相比肝细胞胆小管侧膜转运蛋白Abcb11(t=6.042，P<0.01)、Abcc2(t=9.764，P<0.01)表达量亦有明显下降：而不同组中豚鼠Abcb4表达无改变。 3.采用RT-PCR技术检测肝细胞胆小管侧膜转运蛋白在转录水平上的变化，与对照组相比，致石组豚鼠的肝细胞胆小管侧膜Abcb11(t=6.885，P<0.01)和Abcc2(t=6.794，P<0.01) mRNA水平表达都比较低。致石组中成石豚鼠与未成石豚鼠相比肝细胞胆小管侧膜转运蛋白Abcb11(t=2.824，P<0.05)及Abcc2(t=2.503，P<0.05) mRNA水平的表达量亦有明显下降，统计学有差异。而各组中胆固醇转运蛋白Abcg5及Abcg8在mRNA水平表达未见有明显差异。 三、各组豚鼠胆汁主要成分的变化 生化检测结果显示，与对照组相比，致石组豚鼠胆汁中总胆色素、结合胆色素及游离胆色素水平均升高，其中总胆色素(t=3.722，P<0.01)及游离胆色素(t=3.727，P<0.01)升高显著，游离胆色素与结合胆色素的比值(t=3.528，P<0.01)亦明显升高。致石组胆汁中总胆汁酸水平明显降低(t=4.972，P<0.01)。致石组中成石豚鼠与未成石豚鼠相比，胆汁中总胆色素(t=3.307，P<0.01)及游离胆色素(t=3.447，P<0.01)亦升高显著，结合胆色素轻度升高，游离胆色素与结合胆色素的比值(t=3.545，P<0.01)升高明显。成石豚鼠胆汁中总胆汁酸含量(t=8.040，P<0.01)明显下降。 四、液质联用胆汁代谢组学研究结果 成石豚鼠与未成石豚鼠胆汁相比，M/Z的质量数为483.2 amu(牛璜石胆酸)、515.8 amu(牛璜胆酸)、484.2 amu、312.7 amu(硬脂酸)的物质含量明显升高，M/Z质量数为277.9 amu(亚麻酸)、295.0 amu、297.1 amu、506.2 amu、449.0 amu(甘氨胆酸)的物质含量明显降低。 结论： 1、饮食诱导的豚鼠胆囊胆色素结石形成过程中，存在肝细胞胆小管侧膜转运蛋白表达改变。 2、饮食诱导的豚鼠胆囊胆色素结石形成过程中，出现胆汁成分的改变，表现为胆汁中游离胆色素含量及比值、牛璜胆酸、牛璜石胆酸、硬脂酸等的含量增高，总胆汁酸、甘氨胆酸及亚麻酸等的含量下降。 3、胆色素结石的形成与肝细胞胆小管侧膜转运蛋白异常表达具有一定相关性；肝细胞胆小管侧膜转运功能异常导致胆汁成分变化可能是肝细胞原发性分泌功能参与影响胆色素结石形成的机制之一。 4、液质联用进行胆汁代谢组学研究可行。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

声明

论文一豚鼠胆囊胆色素结石形成过程中中胆汁主要成分的变化

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二豚鼠胆囊胆色素结石形成过程中肝细胞胆小管侧膜转运蛋白表达改变

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三液相色谱—质谱联用豚鼠胆囊胆色素结石形成中胆汁代谢组学的研究

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 肝细胞胆小管侧膜转运蛋白及其在胆结石形成过程中的作用研究进展

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