压疮大鼠骨骼肌组织iNOS的表达及血清中NO、SOD、MDA变化的观察

摘要

目的：压疮(PU)是临床常见的并发症之一，也是治疗和护理的难题，一旦发生，不仅增加患者的痛苦，加重原发疾病，延长病程，严重可因继发感染而危及生命。本研究采用外加物理压力作用于大鼠肢体复制大鼠压疮模型，观察肢体受压后不同时间点iNOS在骨骼肌中的表达情况以及血清中NO、SOD、MDA的含量变化，旨在验证缺血再灌注损伤发生时自由基参与骨骼肌损伤的过程，探讨自由基参与压疮发生的机制。 方法：①健康纯系Wister大鼠54只，雌雄不限，体重180～220g。随机分为1个对照组和8个实验组，每组6只。10％水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉后，使大鼠仰卧固定于大鼠固定板上，用一重量为0.56kg的钢柱垂直施压于大鼠左后肢，主要受压的肌肉为股内收肌和耻骨肌，钢柱和肢体的接触面积为直径1cm的圆形表面，受压部位单位面积承受的压力为70kPa，施压5h。对照组动物麻醉后仰卧固定于大鼠固定板上5h。实验组和对照组大鼠造模后解除固定，常规单只分笼饲养。实验组动物根据肢体受压5h后放松的时间不同共分为8组，分别编号为再灌注组(IR组)：IR0h组、IR4h组、IR12h组、IR24h组、IR3d组、IR1w组、IR2w组、IR4w组。实验组大鼠分别在施压5h后，再灌注0h、4h、12h、24h、3天、1周、2周、4周时，取左后肢施压部位的股内收肌置于4％多聚甲醛中固定后转入30％蔗糖溶液中脱水，OCT常规包埋，冰冻切片机连续切片；另一部分新鲜受压部位骨骼肌，液氮速冻后于—70℃保存，备用做Western—blot检验骨骼肌中iNOS的表达。各组大鼠取腹主动脉血液，离心后取血浆，—70℃冰箱保存备用，用721型分光光度计，根据试剂盒操作规程检测血清中SOD、NO、MDA的水平。对照组大鼠同法取材处理。②对实验组大鼠骨骼肌进行HE染色，以观察肢体受压后不同时间点骨骼肌的结构改变。③提取各组大鼠血清，采用硝酸还原酶法测定NO含量、黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力、硫代巴比妥法测定MDA含量。④应用免疫组织化学染色方法观察肢体受压后不同时间点iNOS在大鼠骨骼肌中的分布和表达。⑤蛋白质免疫印迹(Western—blot)方法检测大鼠骨骼肌中iNOS的表达情况。 结果：⑴对照组骨骼肌纤维形态正常，结构完整。实验组大鼠骨骼肌的发生进行性损伤：出现肌纤维水肿、横纹消失、空泡变、溶解、断裂等变化。以缺血再灌注24小时最重，表现为肌纤维高度水肿，大量骨骼肌纤维空泡变、溶解、断裂；在IR1周、IR2周组可见骨骼肌水肿逐渐减轻，至缺血再灌注4周，组织损伤仍未完全修复，仍可见大量溶解、断裂的骨骼肌，大部分骨骼肌横纹消失。⑵随着再灌注时间的延长，血清中SOD活力呈现先降低后升高的变化：从解除压力后4h逐渐降低，至第3天降至最低，然后逐渐升高，至2周时，仍显著低于对照组(P<0.05)，IR4w组SOD活力恢复正常；血清MDA的含量表现为先升高后降低：从解除压力后0h即显著升高，IR3天组MDA的含量最高，然后逐渐下降，至解除压力后4周大鼠的血清中MDA含量和对照组相比仍然具有显著差异(P<0.05)；血清NO的含量表现为先升高后降低：从0h开始升高，其中IR12h组中NO的含量最高，然后逐渐降低，至2周时，仍显著高于对照组(P<0.05)，IR4周组NO含量恢复正常。⑶iNOS免疫组化切片显示，在IR4h组、IR12h组、IR24h组、IR3天组有大量iNOS阳性表达的骨骼肌纤维，iNOS的表达水平显著高于对照组(P<0.05)。⑷Western—blot方法检测出，IR4h组、IR12h组、IR24h组、IR3天组中iNOS的表达水平明显增加(P<0.05)；组间比较发现：IR12h组和IR0h组、IR4h组、IR1周组、IR2周组相比iNOS的表达水平高，差异具有显著性(P<0.05)；IR24h组和IR0h组、IR4h组、IR3天组、IR1周组、IR2周组相比iNOS的表达水平高，差异具有显著性(P<0.05)；IR4周组和IR3天组、IR4h组、IR12h组、IR24h组相比iNOS的表达水平低，差异具有显著性(P<0.05)。 结论：①缺血再灌注损伤参与压疮的形成，血清SOD活力和MDA含量的时相变化呈负相关性。②压疮大鼠骨骼肌的损伤程度与血清中NO、MDA的含量以及组织中iNOS的表达呈正相关。iNOS活化是压疮缺血再灌注损伤过程中自由基氧化损伤的重要环节。

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综述 压疮发生的压力及缺血再灌注损伤机制研究进展

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