大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化神经元样细胞的实验研究

摘要

目的：
　　 骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells BMSCs）是目前备受关注的一类多向分化潜能组织干细胞，在特定的条件下，MSCs可以跨胚层分化成神经细胞[1]，骨髓间充质干细胞能被诱导分化为神经元样细胞。多种原因致面神经损伤成为口腔颌面部最常见疾病，因神经纤维的不可再生性，严重影响疾病治疗和患者预后，成为人们面临的难题。如何进行疾病治疗，改善患者预后是各国学者广泛研究的焦点，人们将眼光投向干细胞移植治疗，细胞替代治疗成为神经系统疾病治疗的新途径[2]。本实验探讨大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养条件，体外定向诱导传代骨髓间充质干细胞向神经干细胞转化并进一步向神经纽胞分化，对分化后的神经元样细胞进行鉴定。
　　 实验方法：
　　 1、选用健康SD大鼠，分离纯化并培养大鼠骨髓间充质干细胞。
　　 2、应用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达，通过免疫表型鉴定骨髓间充质干细胞。
　　 3、贴壁培养诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化，分为对照组和诱导剂组。对照组中不加诱导剂；诱导剂组分两步诱导：首先加入不同浓度表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子诱导分化剂，连续培养6d；然后应用脑源性神经营养因子和全反式维甲酸继续诱导6d，分别收集诱导后第3d、6d、9d的细胞进行细胞免疫荧光鉴定和免疫组化鉴定。
　　 实验结果：
　　 1、传代第3代骨髓间充质干细胞为梭形成纤维样细胞，均一稳定的表达与间充质干细胞相关的表面抗原标记物CD29，CD44，CD90，阳性率分别为98.76％，98.41％，96.58％，但极少表达CD34，CD45。
　　 2、经碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）共同诱导6d后，诱导剂组巢蛋白（NESTIN）阳性表达率约为83％，而对照组细胞未表达巢蛋白。
　　 3、经脑源性神经营养因子（BDNF）和全反式维甲酸（ATRA）联合诱导6d后，诱导剂组均可见微管相关蛋白2阳性细胞（MAP2），神经丝（NF）及神经元特异性烯醇化酶（NSE）阳性细胞，大部分细胞转变为神经元样细胞形态，与对照组相比有显著差异（P<0.05），对照组细胞形态仍为梭形成纤维样细胞。
　　 结论：
　　 1、实验采用改良的全骨髓贴壁法，操作简单快速，细胞活性好，是一种较为理想的分离和纯化骨髓间充质干细胞的方法。
　　 2、bFGF和EGF两种预诱导剂同时用比bFGF和EGF单一使用效果好。
　　 3、bFGF和EGF联合用的3种浓度（50ug/1、100ug/1、150ug/1）中，100ug/1浓度预诱导效果为最佳，诱导出神经干细胞数量多。
　　 4、经过ATRA和BDNF联合诱导分化的细胞，能够将大部分神经干细胞分化为神经元样细胞。
　　 5、鉴定细胞方法多，本实验应用流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞，免疫组化和免疫荧光鉴定诱导后神经元样细胞。
　　 6、鉴定细胞试剂种类多，本实验应用CD29、CD90、CD45、CD44、CD34、CD90（鉴定骨髓间充质干细胞），NSE、NF、MAP-2，NESTIN（鉴定诱导后神经元样细胞）。

目录

文摘

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英文缩略语

前言

实验材料与方法

实验结果(附论文图片)

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

参考文献

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