成人骨髓间充质干细胞生物学特性及体外诱导分化为神经元样细胞的实验研究

摘要

目的：体外分离、培养成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)，研究hBMSCs生物学特性。观察依达拉奉联合碱性成纤维细胞生长因子(bpFGF)、内皮细胞生长因子(EGF)诱导hBMSCs向神经元样细胞分化的作用，鉴定神经元样细胞功能，为临床进行神经元样细胞移植治疗脊髓损伤等中枢神经系统疾病提供理论基础。
　　 方法：
　　 1.抽取健康成人骨髓，密度梯度离心和贴壁法分离和纯化hBMSCs，原代培养2周后传代，观察细胞形态特征，绘制生长曲线，流式细胞仪鉴定其表面抗原，测定克隆形成率，观察成骨、成脂诱导。
　　 2.用依达拉奉、碱性成纤维细胞生长因子、内皮细胞生长因子和β-巯基乙醇诱导hBMSCs，观察诱导分化后细胞形态变化，免疫细胞化学方法检测细胞NSE、GFAP、MAP2和Nestin表达，western blot检测细胞膜离子通道蛋白Nav1.6、Kv1.2、Kv1.3、Cav1.2的表达，全细胞膜片钳技术行细胞电生理功能检测。
　　 结果：
　　 1.密度梯度离心和贴壁法分离、纯化培养的hBMSCs呈梭状，具有均质性好，细胞增值活力强、传代生长快的特点。本实验培养的hBMSCs生长曲线呈S形；流式细胞仪检测hBMSCs表面抗原，结果显示CD29、CD44、CD105阳性，CD34、CD45阴性；8天和15天的克隆形成率分别为54％、93％；成脂诱导21天，油红O染色呈橘红色，成骨诱导28天，茜素红染色呈深红色。
　　 2.诱导后大部分细胞表现为富有突起的锥状细胞，突起延伸交织成网，依达拉奉+EGF+bFGF组细胞生长状况良好，优于β-巯基乙醇组、依达拉奉组和EGF+bFGF组，呈现典型神经元样细胞。
　　 3.空白组NSE、GFAP、Nestin和MAP2表达均为阴性，依达拉奉+EGF+bFGF组NSE阳性细胞率高于其他三个实验组，P<0.05；GFAP在实验组中弱表达，Nestin、MAP2在实验组组中表达阴性。
　　 4.实验组和空白组均表达膜离子通道蛋白Nav1.6、Kv1.2、Kv1.3、Cav1.2。实验组Nav1.6、Kv1.2、Kv1.3表达上调，Cav1.2表达基本不变。Kv1.2、Kv1.3表达与空白组比较，P<0.05。
　　 5.分化后的神经元样细胞静息膜电位值增大，与空白对照有统计学意义；空白组和实验组中至少存在三种以上外向钾电流，包括四乙铵(TEA)敏感的延迟整流钾电流(IKDR)、克霉唑(clotrimazole)敏感钙激活钾电流(IKCa)和瞬间外向钾电流(Ito)。分化后的神经元样细胞电流强度幅值显著性增高。本实验尚未发现硝苯地平(nifedipine)敏感型的L-钙电流(ICaL)和TTX敏感型的钠电流(INa)。
　　 结论：
　　 1.用密度梯度法和贴壁法分离培养的hBMSCs具有自我更新、快速形成克隆能力和多向分化潜能。
　　 2.依达拉奉可以诱导hBMSCs分化为神经元样细胞，依达拉奉+EGF+bFGF诱导hBMSCs向神经元样细胞分化作用高于其他组。
　　 3.体外分离培养的hBMSCs分化的神经元样细胞具有可兴奋性的功能性神经元的离子基础，具有功能性神经元的某些电生理特性。hBMSCs具有分化为功能性神经元的潜能。