人类丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白12（HCBP12）的克隆表达与功能研究

摘要

研究背景与目的丙型肝炎病毒(HCV)感染所致丙型肝炎是慢性肝病及肝细胞癌(HCC)的原因之一：但迄今尚无疫苗和特异有效的治疗方式．深入研究丙型肝炎病毒的感染与致病机制具有重大的现实意义。在筛选了肝细胞内能与HCV Core相互结合的蛋白，并将其中一个在HCC中作用不清的新基因命名为HCV Core结合蛋白12(HCBP12)的基础上，本研究拟通过亚细胞定位、原核表达、抗体制备和肝细胞内结合蛋白的筛选等几个方面初步阐释该基因在HCC发病过程中的生物学功能。 方法 1．构建重组绿色荧光表达载体pEGFP-C1-HCBP12，转染HepG2细胞，24hr后在荧光倒置显微镜下观察荧光情况。2．构建原核表达载体pET-32a(+)．HCBP12，转化BL21宿主菌后经IPTG诱导，获得了带有组氨酸标签的重组融合蛋白的优化表达，并用SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白的特异性进行分析和验证。然后利用Ni+亲和柱纯化表达蛋白并免疫新西兰兔，获得抗HCBP12多克隆抗体。以纯化HCBPl2为抗原，利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。3．构建酵母细胞表达载体pGBKT7-HCBP12，转化AH109酵母菌株并获得表达，利用Western blot对表达蛋白进行验证。与含有肝细胞文库质粒的Y187酵母菌株配合，进行酵母双杂交，筛选与HCBPl2具有相互作用的蛋白。 结果 1．细胞浆出现明显的绿色荧光信号，提示HCBP12主要定位于胞浆内。2．HCBP12融合蛋白在原核表达系统成功表达。SDS-PAGE分析表明其为包涵体表达。成功获得了融合蛋白纯品及兔抗HCBP12克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价>1：512，000，Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。3．HCBP12融合蛋白经Western blot验证在酵母菌株表达成功。利用酵母双杂交技术筛选出12个与HCBP12相互作用的蛋白，其中包括人类载脂蛋白C-I/B、人类线粒体蛋白、人类金属硫蛋白2A、人类β-2微球蛋白、人类羧酸脂酶4和人类丝氨酸肽酶抑制剂等已知功能蛋白及1个未知功能蛋白。将新基因提交GenBank数据库，并命名为HCBP12BPA。结论本研究证实了HCBP12定位于肝细胞浆内，可与肝细胞的载脂蛋白、金属硫蛋白2A、β-2微球蛋白、羧酸脂酶等多种蛋白结合，在肝细胞的增殖、凋亡，细胞内物质代谢等过程具有不可忽视的作用。本研究成功利用大肠杆菌原核表达系统对其进行了诱导表达，表达蛋白通过亲和层析技术进行了纯化，并应用纯化蛋白成功制备了具备高效价、高特异性的兔抗HCBP12多克隆抗体。这些都为日后应用其他包括免疫组化、哺乳动物双杂交、细胞增殖、细胞信号转导等方法深入研究HCBP12在HCC发生发展过程中的意义奠定了物质基础。

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摘要

前言

第一部分HCBP12的克隆化与亚细胞定位

第二部分HCBP12重组蛋白的表达及多克隆抗体的制备

第三部分HCBP12相互作用蛋白的筛选

结论

参考文献

综述丙型肝炎病毒Core和NSS5A蛋白的结构特点和生物学功能研究进展

致谢