利用大肠杆菌和耻垢分支杆菌表达系统制备结核诊断抗原的研究

摘要

目的：构建结核分支杆菌融合基因lhp-esat6和2×esat-6原核表达载体，分别在大肠杆菌和耻垢分支杆菌中同时诱导表达融合蛋白rCFP10-ESAT6和rdESAT-6纯化蛋白，Western-blot分析其抗原性，并初步评估其诊断价值。 方法：以结核分支杆菌H37Rv基因组DNA为模板，经PCR扩增lhp和esat-6基因；用基因延伸拼接技术(SOE)将lhp和esat-6基因体外重组，构建thp-esat6融合基因，并将其克隆至pET28a和pMF41质粒中分别构建pET28a-lhp-esat6和pMF41-lhp-esat6原核表达载体。以DNA疫苗HG856A2为模板，经PCR扩增2×esat6基因，并将其克隆至pET28a和pMF41质粒中分别构建pET28a-2xesat-6和pMF41-2×esat-6原核表达载体。将pET28a-lhp-esat6和pET28a-2×esat-6重组质粒转化E.coliBL21(DE3)，以IPTG诱导表达融合蛋白rCFP-ESAT6(E.coll)和rdESAT-6(E.coll)。将pMF41-lhp-esat6和pMF41-2×esat-6重组质粒电转化耻垢分支杆菌M.smegmatis，以乙酰胺诱导表达融合蛋白rCFP10-ESAT6(M.smeg)和rdESAT-6(M.smeg)。通过SDS-PAGE鉴定其表达形式，用Ni2+柱亲和层析纯化融合蛋白；用rESAT-6小鼠抗血清对纯化的四种融合蛋白进行Western-blot分析抗原性；用间接ELISA方法检测其抗结核抗体的敏感性和特异性，并以重组蛋白刺激IFN-γ全血试验(IGRA)评估重组抗原在结核病诊断中的价值。 结果：成功构建了原核表达载体pET28a-lhp-esat6、pET28a-2×esat-6、pMF41-lhp-esat6和pMF41-2×esat-6。融合蛋白在两种表达系统中均以包涵体形式表达；经Ni2+柱亲和纯化的样品SDS-PAGE分析纯度在95％以上，并且四种融合蛋白均可与rESAT-6小鼠抗血清发生特异性反应。间接ELISA检测结果表明：用rCFP-ESAT6纯化蛋白进行结核病血清学诊断的敏感性为25％(5/20)，特异性为95.8％(23/24)；用rdESAT-6纯化蛋白进行结核病血清学诊断的敏感性为30％(6/20)，特异性为95.8％(23/24)，略好于文献报道的rESAT-6结果。 结论：本研究成功制备了结核分支杆菌的四种融合蛋白，并以此抗原建立了间接ELISA方法用于检测结核抗体试验；以及检测细胞免疫的IGRA试验，为以rCFP10-ESAT6和rdESAT-6为抗原的结核病免疫学诊断试剂研制奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号与缩略语说明

声明

第一章综述

1.1结核概况

1.1.1结核杆菌的感染与免疫机理

1.1.2 BCG与结核病

1.2结核病诊断学研究进展

1.3结核特异性诊断抗原

1.4本研究的内容、目的和意义

第二章利用E.coli表达系统制备rCFP10-ESAT6、rdESAT-6重组蛋白

2.1材料和方法

2.1.1菌株和质粒

2.1.2酶、引物和血清

2.1.3试验试剂与仪器设备

2.1.4 E.coli感受态细胞的制备

2.2重组蛋白的表达、纯化及其抗原性分析

2.2.1 lhp-esat6和2×esat-6融合基因的扩增

2.2.2 pET28a-lhp-esat6和pET28a-2xesat-6重组质粒的构建

2.2.3重组蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析

2.2.4重组蛋白的纯化、透析及其抗原性分析

2.3结果

2.3.1 lhp-esat6和2×esat-6融合基因的获得

2.3.2 pET28a-lhp-esat6和pET28a-2×esat-6重组质粒的鉴定

2.3.3 SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导表达情况

2.3.4重组蛋白的纯化及其抗原性分析

2.4讨论

第三章利用M.smeg表达系统制备rCFP10-ESAT6、rdESAT-6重组蛋白

3.1材料和方法

3.1.1菌株和质粒

3.1.2酶、引物和血清

3.1.3试验试剂与仪器设备

3.1.4 M.smeg感受态细胞的制备

3.2重组蛋白的表达、纯化及其抗原性分析

3.2.1 lhp-esat6和2×esal-6融合基因的扩增

3.2.2 pMF41-lhp-esat6和pMF41-rdesat-6重组质粒的构建

3.2.3重组蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析

3.2.4重组蛋白的纯化、透析及其抗原性分析

3.3结果

3.3.1 Zhp-esat6和2×esat-6融合基因的获得

3.3.2 pMF41-lhp-esat6和pMF41-2×esat-6重组质粒的鉴定

3.3.3 SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导表达情况

3.3.4重组蛋白的纯化及其抗原性分析

3.4讨论

第四章重组蛋白在结核病诊断中的初步应用

4.1材料与试剂

4.1.1临床血清样本

4.1.2检测试剂与材料

4.1.3主要仪器设备

4.2重组蛋白的应用诊断试验

4.2.1 ELISA方法的建立

4.2.2重组蛋白刺激IFN-γ全血试验

4.3重组蛋白诊断应用结果分析

4.3.1重组蛋白ELISA检测血清的特异性和敏感性

4.3.2重组蛋白刺激IFN-γ ELISA结果分析

4.4讨论

结论

致谢

参考文献

附录

攻读学位期间的研究成果