结核分枝杆菌GlmU在耻垢分枝杆菌中的高表达及反义RNA表达系统的优化

摘要

由结核分枝杆菌引起的结核病是严重危害人类健康的三大疾病之一。世界卫生组织（WorldHealthOrganization，WHO）的报告显示，世界人口的三分之一感染过结核杆菌，全世界每20秒就有一人死于结核病。由于耐多药（multidrugresistant，MDR）甚至是广泛耐药（extensivedrugresistant，XDR）结核杆菌的出现，许多一线甚至一些二线抗结核药物都无法有效治疗结核病，因此寻找新的抗结核药物迫在眉睫。 结核分枝杆菌的细胞壁在其生存和增殖过程中起着重要的作用，其核心结构由肽聚糖、阿拉伯半乳聚糖、分枝菌酸三种组分连接组成。其中分枝菌酸和聚阿拉伯糖半乳糖通过衔接双糖（L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺）共价连接到肽聚糖分子上。UDP-N-乙酰葡糖胺是N-乙酰葡糖胺的糖基供体，在UDP-N-乙酰葡糖胺的生物合成中，glmU基因编码的GlmU蛋白具有葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性和N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷转移酶活性，催化最后两步反应。本实验室张文利通过基因敲除的方法证明了glmU基因为分枝杆菌生长必需基因，因此，GlmU可作为很好的抗结核新药靶标。 本实验己建立了测定GlmU酶活性的方法，并以此作为筛选抗GlmU酶抑制剂的分子模型。因此，我们需要构建能上调GlmU蛋白表达的细胞模型来进一步筛选抗GlmU酶抑制剂。另外，为了进一步研究GlmU蛋白表达的下降对分枝杆菌细胞壁结构的影响，我们需要构建能下调GlmU蛋白表达的系统，来下调GlmU蛋白表达水平，并用本实验制备的抗GlmU的多克隆抗体对glmU反义RNA表达系统所表达的GlmU水平进行检测。 本论文的目的是：（1）在宿主菌mc2155中高表达TbGlmU，并用检测GlmU酶蛋白活性的方法来鉴定TbGlmU在耻垢中的高表达；（2）优化受四环素诱导的glmU反义RNA表达系统，用本实验室制备的GlmU多克隆抗体检测GlmU蛋白的表达水平；（3）用扫描电镜观察GlmU表达减弱的耻垢分枝杆菌形态学变化。 本论文所获得的结果如下： 1.表达载体pVV2-TbglmU的构建用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切pET16b-TbglmU质粒，回收和纯化glmU基因，将其连接到pVV2表达载体的NdeⅠ和BamHⅠ位点，构建pVV2-TbglmU表达质粒。GlmU蛋白的N端与质粒上的组氨酸标签形成融合蛋白。 2.TbGlmU蛋白在耻垢分枝杆菌mc2155中的高表达及鉴定将pVV2-TbglmU质粒转化到mc2155感受态细胞中使其表达GlmU蛋白。用超声方法破碎携带pVV2-TbglmU的mc2155菌，对上清和沉淀组分进行SDS-PAGE和Westernblotting分析，结果表明TbGlmU蛋白在mc2155中可溶性表达。并利用其酶活性检测方法来鉴定GlmU在耻垢分枝杆菌中的高表达。 3.反义RNA表达载体pMind-SmglmU（360bp）-AS的构建用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切pMD18-SmglmU（360bp）质粒，回收和纯化glmU基因片段，将其连接到pMind反义表达载体的NdeⅠ和BamHⅠ位点，构建pMind-SmglmU（360bp）-AS反义表达质粒。 4.glmU反义RNA的诱导表达与GlmU蛋白的检测分别用0ng/ml、5ng/ml、20ng/ml的四环素诱导携带pMind-SmglmU（360bp）-AS表达载体的mc2155菌株表达反义RNA，绘制细菌生长曲线，并用本实验室制备的GlmU多克隆抗体检测GlmU蛋白的表达水平。结果表明20ng/ml四环素对mc2155/pMind-SmglmU（360bp）-AS的生长有明显的抑制作用，Westernblotting结果表明经过20ng/ml四环素诱导的mc2155/pMind-SmglmU（360bp）-ASGlmU蛋白的表达明显减少，证明了glmU反义RNA下调了耻垢分枝杆菌GlmU表达水平。 5.经20ng/ml四环素诱导的mc2155/pMind-SmglmU（360bp）-AS菌株细胞形态的变化将经20ng/ml四环素诱导的mc2155/pMind-SmglmU（360bp）-AS菌株细胞用扫描电镜观察其细胞形态。结果显示生长了48小时后，菌体表面出现明显的凸起，甚至溶胀，菌体轮廓亦不清晰，似乎都粘连在一起。说明本实验优化的反义RNA表达系统发挥了下调GlmU表达的作用，更进一步说明了GlmU蛋白对细胞壁完整性有影响。 结论： 1.在耻垢分枝杆菌中高表达出可溶性TbGlmU蛋白，构建了能上调GlmU表达的菌株，为筛选TbGlmU酶抑制剂提供了细胞模型。 2.优化了glmU反义RNA表达系统，构建了能下调GlmU表达的菌株，研究了GlmU表达的减少对耻垢分枝杆菌细胞壁结构的影响。

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综述 反义RNA技术及其在医学上的应用

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结论

今后将要完成的科研工作

参考文献

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