F18大肠杆菌黏附素菌体表面功能性展呈及其染色体-质粒平衡致死系统的构建

摘要

F18大肠杆菌是断奶仔猪腹泻(PWD)和仔猪水肿病(ED)的重要病原。该病原菌包括F18ab和F18ac两种血清型。PWD和ED产生的前提条件是该病原菌首先能定植在易感仔猪小肠上皮细胞粘膜表面，这个关键过程是由黏附素直接介导的。相关研究表明F18菌毛的黏附素为菌毛亚单位FedF，FedF受体结合域位于其分子内第60和109位氨基酸残基之间。运用V型分泌系统MisL，成功地构建了在大肠杆菌DH5a菌体表面展示F18大肠杆菌黏附素FedF及黏附素受体结合域FedFl的载体pnirBMisL-fedF和pnirBMisL-fedFl，经厌氧诱导后，与兔抗F18ab菌毛FedF亚单位单因子血清做玻板凝集试验发生明显的凝集反应，并且也能较好地黏附于易感仔猪小肠上皮细胞，而菌体表面展示黏附素FedF突变体FedF(M)(黏附素受体结合域第88和89位组氨酸残基双突变为丙氨酸)的重组菌则失去上述凝集和黏附特性。以上研究结果表明，F18大肠杆菌黏附素FedF及其受体结合域FedFl在大肠杆菌DH5a菌体表面得到了功能性表达展呈，也证明了位于FedF受体结合域内第88和89位组氨酸残基对FedF受体结合域的形成至关重要。 为深入研究F18大肠杆菌黏附素在染色体．质粒平衡致死系统中的表达应用，采用Red同源重组技术对大肠杆菌DH5a染色体上asd基因进行敲除。首先PCR扩增出两翼与asdi基因上下游序列同源，中间为氯霉素抗性基因的DNA片段。通过电转化，将外源DNA片段转化大肠杆菌DH5a，在Red重组酶的帮助下，外源DNA片段与染色体上同源区域发生重组，通过氯霉素抗性平板筛选阳性克隆，对筛选得到的阳性克隆再导入编码Flp位点特异性重组酶的质粒pCP20通过第二次重组以去除抗性基因。构建成的大肠杆菌DH5a asd基因缺失突变株(DH5α△asd)失去了在普通LB平板上生长的能力，只有补加DAP或者导入表达asd的质粒才能在LB平板上生长。 根据大肠杆菌K12菌株asd基因两侧序列设计一对引物，用PCR的方法扩增出含有启动子和RBS的DH5a asd全基因，然后将其克隆入上述构建好的能菌体表面展示F18大肠杆菌黏附素的载体pnirBMisL-fedF中，使氨苄抗性基因失活的同时表达asd基因。构建成的质粒载体pnirBMisL-fedF-asd转化大肠杆菌DH5a△asd，两者在asd功能上形成互补，构成了一个染色体-质粒平衡致死系统。该系统在营养选择压力下经20次传代培养没有发现质粒丢失，证明了该系统的稳定性。间接免疫荧光和仔猪小肠上皮细胞体外黏附试验表明该系统在菌体表面功能性表达展呈F18大肠杆菌黏附素。鉴于V型分泌系统介导的菌体表面展示有望作为开发细菌活载体疫苗的有效工具，我们运用该系统成功地进行了F18大肠杆菌黏附素及其受体结合域的菌体表面展呈，并构建了能无抗性菌体表面展示F18大肠杆菌黏附素的染色体-质粒平衡致死系统，为研制预防PWD和ED的亚单位疫苗奠定了基础。

目录

论文说明：符号说明

摘要

文献综述

研究一Ⅴ型分泌系统菌体表面展示F18大肠杆菌黏附素的研究

1.材料与方法

2.结果

讨论

参考文献

研究二大肠杆菌DH5α△asd缺失突变株的构建及功能分析

1.材料与方法

2.结果

3 讨论

参考文献

研究三F18大肠杆菌黏附素在染色体-质粒平衡致死系统中的表达

1.材料与方法

2 结果

3.讨论

参考文献

致谢

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