大肠杆菌Nissle1917染色体—质粒平衡致死系统的构建及功能研究

摘要

近年，有关细菌靶向治疗肿瘤的研究取得了巨大进展，但大量的研究工作主要集中在利用活菌本身或其产物使肿瘤局部破坏或引发机体免疫反应来达到控制、治疗肿瘤的目的，因其缺乏特异性和针对性，且毒副作用大，难以推广应用和临床研究。非致病性大肠杆菌Nissle1917(O6∶K5∶H1)作为一种益生元在欧洲已经获得治疗肠病的认证长达九十余年，大量的试验、临床依据表明，这种细菌药物是有效和安全的。有研究表明大肠杆菌Nissle1917对血清敏感，对实体瘤具有偏好性且可在实体瘤内大量增殖，鉴于这一特性，人们尝试以其为宿主菌构建可表达外源基因药物的工程菌来特异性的治疗癌症。但大肠杆菌等宿主菌中重组质粒的选择和维持大多依赖于抗生素及抗生素抗性基因，在工业、医疗和食品行业应用中存在生物安全的风险，因此国际生物技术研究和管理部门致力于新型非抗生素选择标记方法的研究。目前，能替代抗生素抗性标记的主要有营养缺陷型标记，即所谓的染色体--质粒平衡致死系统，原理是构建宿主菌的营养缺陷突变子，再将缺陷基因的正常拷贝构建于质粒载体，通过质粒与宿主菌染色体之间的基因互补达到稳定重组质粒的目的。
　　 基于以上考虑，本研究利用高效、便利的Red/ET同源重组和位点特异性重组技术对大肠杆菌Nissle1917谷氨酰胺合成酶基因(glnA)进行敲除，获得大肠杆菌Nissle1917谷氨酰胺营养缺陷株。再克隆全长的glnA基因，以诱导型表达质粒pGB-Ptet-Amp为基础，采用同源重组替换该质粒载体上的氨苄青霉素(Amp)抗性基因，获得无抗性筛选标记基因的互补质粒pGB-Ptet-glnA，通过电击转化大肠杆菌Nissle1917 glnA基因缺失突变株，建立起无抗性标记的染色体--质粒平衡致死系统。
　　 为深入研究大肠杆菌Nissle1917染色体--质粒平衡致死系统的功能，从恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440中扩增编码抗癌肽的azurin基因并在N端融合胡萝卜软腐欧文氏菌果胶酶pelB基因信号肽序列，克隆入平衡致死系统的互补表达质粒pGB-Ptet-glnA，获得相应的工程菌。进一步的研究表明，该工程菌在没有抗生素为选择压力的条件下能体外稳定地增殖和传代；在0.6μmol/L四环素存在的条件下可高效诱导抗肿瘤肽azurin的分泌表达；体内试验表明工程菌在荷肿瘤小鼠体内具有与野生型E.coli Nissle1917等同的肿瘤靶向性。该系统的建立为利用细菌在体内特异性传递外源药物提供了一个良好的平台，为利用该系统治疗疾病打下了技术基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1.引言

1.1细菌靶向治疗肿瘤的概述

1.1.1细菌靶向治疗肿瘤的研究进展

1.1.2细菌靶向治疗肿瘤的机制

1.1.3细菌靶向治疗肿瘤的优势

1.1.4细菌靶向治疗肿瘤的策略

1.1.5益生型大肠杆菌Nissle1917

1.1.6大肠杆菌Nissle1917作为肿瘤靶向治疗载体的优势

1.2染色体-质粒平衡致死系统

1.2.1染色体—质粒平衡致死系统的概念和原理

1.2.2常用的营养缺陷标志基因

1.2.3染色体—质粒平衡致死系统的应用

1.3 Red/ET同源重组

1.3.1 Red/ET同源重组的原理

1.3.2 Red/ET同源重组的优点

1.3.3 Red/ET同源重组的应用

1.4立题依据和意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2引物

2.1.3培养基和抗生素

2.1.4试剂

2.1.5反应体系

2.1.6仪器与设备

2.2方法

2.2.1大肠杆菌Nissle1917 glnA基因缺失突变株的构建

2.2.2 Red/ET重组替换glnA基因

2.2.3位点特异性重组去除抗性筛选标记基因

2.2.4互补表达质粒pGB-Ptet-glnA的构建及转化

2.2.5互补菌株EcN △glnA(pGB-Ptet-glnA)生长曲线及质粒稳定性

2.2.6互补菌株肿瘤靶向性试验

2.2.7 pelB-azurin基因片段的克隆及诱导表达

2.2.8 azurin基因在E.coli BL21(DE3)中的克隆表达及抗体制备

2.2.9 Western blotting分析

3结果与分析

3.1.Ecoli Nissle1917 △glnA的构建

3.1.1 EcN glnA基因的克隆及测序

3.1.2 loxP-Kan抗性筛选盒的PCR扩增

3.1.3 EcN △glnA的鉴定

3.2互补表达质粒pGB-Ptet-glnA的构建

3.2.1 glnA-Kan打靶片段的扩增

3.2.2互补质粒pGB-Ptet-glnA的鉴定

3.3 EcN △glnA(pGB-Ptet-glnA)的生长曲线和质粒稳定性

3.3.1互补菌生长曲线

3.3.2互补质粒的稳定性试验

3.4互补菌肿瘤靶向性验证

3.5.azurin蛋白的表达纯化及抗体制备

3.5.1 azurin基因的克隆和诱导表达

3.5.2 azurin蛋白的纯化及多克隆抗体的制备

3.6外源azurin基因的分泌表达及western blotting检测

4讨论

结论

参考文献

硕士期间撰写和发表的与本课题相关的学术论文

致谢