BLG调控区指导hLF基因在GMECs、SP2/0和杂交瘤细胞中表达的研究

摘要

本实验利用电转染法将含有人乳铁蛋白基因的表达载体，导入到山羊乳腺上皮细胞和小鼠骨髓瘤细胞中，经G418及PCR筛选获得阳性细胞；转染细胞增殖后经催乳素诱导，培养液上清通过ELISA检测证明，转染细胞表达并分泌出入乳铁蛋白。 利用细胞融合技术将未转染人乳铁蛋白基因的小鼠骨髓瘤细胞与表达人乳铁蛋白的ICR小鼠的脾细胞进行融合，经过HAT筛选获得杂交瘤细胞株。细胞增殖后经催乳素诱导，培养液上清通过ELISA检测。同样获得了表达人乳铁蛋白的阳性杂交瘤细胞株。 1、BLG调控序列与人乳铁蛋白功能基因构建表达载体 表达载体的组成：山羊β-乳球蛋白基因调控序列，包括4.2kb的5'端和1.8kb的3'端，人乳铁蛋白(hLF) cDNA，人巨细胞病毒(CMV)增强子序列及SV40polyA序列和新霉素抗性筛选基因(Neor)等基因元件 2、奶山羊乳腺上皮细胞系的建立 从泌乳奶山羊的乳腺实质组织中分离得到原代乳腺上皮细胞，由于原代上皮细胞中含成纤维样细胞混合生长，所以传代时本实验采用分步胰酶消化反复贴壁法在DMEM/F12培养液中经2～3次的选择传代可获得纯的乳腺上皮细胞系。 3、表达人乳铁蛋白的奶山羊乳腺上皮细胞株和SP2/0细胞株的建立 通过电转染法将含有Neor标记基因的BLC-14载体基因片段导入奶山羊乳腺上皮细胞、小鼠骨髓瘤细胞中，经G418(400μg/ml)抗性筛选培养两周左右，获得59株抗G418的单克隆乳腺上皮细胞株和44株抗G418的单克隆小鼠骨髓瘤阳性细胞株。对扩大培养的抗性细胞株进行催乳素诱导，收集诱导24h后的细胞上清液进行ELISA检测，结果显示有8株G418抗性乳腺上皮细胞株能够表达重组人乳铁蛋白，乳腺上皮细胞的平均表达水平是0.781μg/mL，以及12株表达人乳铁蛋白的小鼠骨髓瘤的阳性细胞株，小鼠骨髓瘤细胞的平均表达水平是0.435μg/mL。 4、表达人乳铁蛋白的杂交瘤阳性细胞株的建立 通过未转染人乳铁蛋白基因的小鼠骨髓瘤细胞与表达人乳铁蛋白的转基因小鼠的脾细胞融合，经过HAT筛选获得54株整合有人乳铁蛋白基因的杂交瘤细胞株。经过蛋白质表达检测共有6株稳定表达的阳性杂交瘤细胞株，阳性杂交瘤细胞株平均表达水平是0.653μg/mL。 结果表明，本实验室所构建的BLC14载体既能够在山羊乳腺上皮细胞表达，同样在非特异性宿主细胞—小鼠骨髓瘤细胞和杂交瘤细胞中也能够表达的结果，可以推测出BLG调控序列与人乳铁蛋白功能基因构建的表达载体转染小鼠骨髓瘤细胞后，可以对小鼠骨髓瘤细胞的生物学特性产生影响，导致骨髓瘤细胞表达出功能性的人乳铁蛋白。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第一章文献综述

1动物细胞表达系统

1.1哺乳动物细胞表达系统

2乳腺特异性表达载体的研究

2.1顺式作用元件

2.2反式作用因子

2.3应用乳蛋白基因构建乳腺生物反应器表达载体

3乳铁蛋白的作用机制

3.1抗菌性过去的很多研究都证明了LfcinH和LfcinB在体外的抗菌活性

3.2抗真菌活性和抗寄生虫活性

3.3抗病毒活性

3.4免疫调控作用

4 Lfcin的转基因研究进展

第二章奶山羊乳腺上皮细胞的培养

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1奶山羊乳腺上皮细胞的原代培养

2.2奶山羊乳腺上皮细胞的纯化与传代

2.3细胞生长曲线

2.4细胞的贴壁率

3讨论

第三章人乳铁蛋白基因电转染山羊乳腺上皮细胞克隆的获得

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1细胞转染

2.2抗性细胞株的诱导表达及检测

3讨论

3.1细胞的电转染

3.2 DNA浓度与质量

3.3 G418的筛选

3.4单细胞株的获得

3.5诱导表达

第四章人乳铁蛋白基因电转染SP2/0细胞克隆的获得

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1电脉冲参数的优化

2.2单克隆细胞株的建立

2.3转染细胞DNA的PCR检测

2.4转染DNA后的细胞上清液的蛋白质表达检测

3讨论

3.1细胞大小、类型和生长阶段

3.2 SP2/0的运用

第五章表达人乳铁蛋白的杂交瘤细胞株的建立

1材料与方法

1.1材料

2方法

2.1骨髓瘤细胞的准备

2.2脾脏淋巴细胞的准备

2.3饲养细胞的制备

2.4细胞融合

2.5细胞株的PCR检测(同上)

2.6阳性细胞的ELISA检测

3结果

3.1杂交瘤细胞观察及换液

3.2融合细胞DNA的PCR检测

3.3杂交瘤细胞上清液的蛋白质表达检测.如图3-2

4讨论

4.1淋巴细胞杂交瘤技术

4.2骨髓瘤细胞的状态

4.3 HAT筛选的原理

结论

参考文献

致 谢