鼠抗人ICOS单克隆抗体的研制及GL50-ICOS信号对T细胞共刺激作用的研究

摘要

ICOS(InducibleCostimulator)及其配体GL50是新近发现的CD28／B7家族的一对新成员。ICOS主要表达在活化的T细胞上，GL50可持续表达在B淋巴细胞、巨噬细胞表面或诱导表达于成纤维细胞表面。GL50-ICOS的相互作用，对机体再次免疫应答过程中T细胞的增殖、活化、分化、细胞因子的分泌以及B细胞的增殖、分化、抗体分泌等都发挥了重要的作用。目前的研究业已证明：GL50-ICOS信号途径在机体炎症、自身免疫性疾病、肿瘤和移植排斥等免疫应答过程中发挥着重要的调节作用。对该信号途径的有效调节将不仅为理解人体复杂、精细的免疫应答系提供新的视角，而且还具有潜在的临床应用前景。因此特异性鼠抗人ICOS单克隆抗体的研制在为研究GL50-ICOS信号途径生物学效应提供有力的研究工具的同时，也具有潜在的临床应用价值。 一分泌鼠抗人ICOS单抗的杂交瘤细胞株的制备及其生物学特性的鉴定 以肺癌病人胸水中高表达ICOS的活化T细胞为免疫原，免疫BALB／c小鼠，采用B淋巴细胞融合技术，将反复免疫后的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0进行细胞融合，以ICOS-L929转基因细胞作为阳性筛选细胞，以转空载体的对照细胞mock-L929作为阴性对照细胞，经免疫荧光标记分析及抗体分泌阳性孔内杂交瘤细胞的反复筛选，并经多次克隆化培养，最终获得l株持续、稳定分泌鼠抗人ICOS单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3F8。经快速定性试纸法分析鉴定，3F8的重链为IgGl；而轻链为κ。经体外连续传代(40代)培养，液氮冻存半年后复苏，仍生长良好，稳定分泌抗体。继而采用本室建立的腹水诱生和纯化方案，腹水形成阳性率为95％以上，腹水的产量平均约为5．0ml／只小鼠。经ProteinG亲和层析柱分离纯化，腹水型单抗纯化后蛋白含量在0．8~10mg/m1之间。纯化后单抗的效价为l：1000以上，抗体蛋白用于间接免疫荧光分析的用量为0．2-2μg/1×106细胞。Westernblot分析表明这株单抗均具有良好的识别ICOS分子的能力。竞争结合实验进行分析，结果表明3F8mAb与阳性对照抗体识别不同的抗原位点。经间接免疫荧光法分析，3F8mAb与诱导活化的外周血T细胞结合的阳性率与商品化抗体的结合阳性率相当，提示3F8mAb能很好的识别并结合活化T细胞表面的ICOS分子。在人外周血T细胞用抗人CD3激发型单抗或联合抗CD3和抗CD28单抗激发的基础上，加入抗ICOS单抗3F8共培养后，MTT法显示，与对照组相比，抗ICOS单抗3F8具有明显的促T细胞增殖的作用(P<0．05)，并且联合抗CD28单抗，促增殖效应则更为显著。ELISA法检测细胞因子的分泌发现，激发型ICOSmAb3F8介导的协同刺激信号可以显著上调T细胞对IL．10的分泌，但对IL-2的分泌影响不大，然而，激发型CD28mAb主要促进T细胞IL-2的分泌。 二人GL50转基因细胞的构建及GL50．ICOS信号对T细胞共刺激作用的研究 1．人GL50转基因细胞株的构建 将插入GL50全长cDNA片段的重组表达载体pEGZ／Term，通过脂质体转染技术将重组表达载体与辅助病毒载体共转染包装细胞293T，用其培养上清感染L929细胞72h后，经Zeocin筛选出稳定表达GL50分子的L929细胞株(GL50-L929)。经体外长期传代和液氮反复冻存和复苏，转基因细胞生长良好，GL50的表达稳定在95％以上。 2．GL50-ICOS信号对T细胞共刺激作用的研究 将人外周血T细胞用抗人CD3激发型单抗或联合抗CD3和抗CD28单抗激发，加入刺激细胞GL50-L929或mock-L929共培养4d。MTT细胞增殖结果分析显示，GL50-L929细胞能有效地促进T细胞增殖，联合抗CD28单抗促增殖效应则更为显著。ELISA法检测培养上清细胞因子表明，GL50-L929能明显促进T细胞对IL-10的分泌，对IL-2的分泌影响不大。实验结果显示，特异性鼠抗人ICOS单抗3F8能够有效阻断GL50-L929转基因细胞介导的活化T细胞的增殖反应及细胞因子的分泌。 综上所述，本研究成功研制了l株能稳定分泌特异性鼠抗人ICOS功能型单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并在成功构建GL50转基因细胞的基础上对ICOS的生物学功能作了初步探讨，为研究GL50-ICOS共刺激信号在免疫调节中的作用提供了新的视角。

目录

文摘

英文文摘

苏州大学学位论文独创性声明及使用授权的声明

缩写词表

研究背景

第一部分鼠抗人ICOS功能型单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

第二部分人GL50转基因细胞的构建及GL50-ICOS信号对T细胞共刺激作用的研究

结论与展望

攻读学位期间公开发表及待发表的论文

课题资助情况

致谢