抗人CD133单克隆抗体的制备及CD133抗原在肝癌组织中的表达

摘要

肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界范围内死亡率最高的恶性肿瘤之一，也是我国常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，发展迅速，治疗困难，总体疗效不理想。
　　 肿瘤干细胞(Tumorstemcell，TSC;亦称癌干细胞，cancerstemcell，CSC)的概念是在长期的研究中逐步发展形成的。肿瘤干细胞是指癌瘤组织中少量存在的具有自我更新能力、分化潜能的细胞，该群细胞属于成体干细胞的范畴且自我更新失控。研究认为肿瘤干细胞是肿瘤形成的起始细胞，可能是肿瘤发生、发展、转移、复发的根源。目前研究表明，肿瘤干细胞存在于包括白血病、乳腺癌、脑肿瘤、结直肠癌及胰腺癌等恶性肿瘤中。而对肝细胞肝癌的研究显示肝细胞癌的发生发展过程中可能也有肿瘤干细胞的参与。
　　 在不同类型的肿瘤中研究者们发现了不同的肿瘤干细胞表面标记分子。而CD133分子则是其中的重要成员之一。人CD133基因位于4号染色体，基因全长约160Kb，含有27个外显子，开放性读框(ORF)为2598bp，编码865个氨基酸（AA），分子量约为120KD，基因的编码产物——CD133抗原为5跨膜糖蛋白。
　　 大量研究表明，通过细胞表面标记CD133分子，可有效地识别和鉴定多种肿瘤的肿瘤干细胞，从而对肿瘤干细胞的特性进行分析。并且CD133与肿瘤的转移、肿瘤的血管生成都有关系。另外研究者报道，可通过检测CD133mRNA水平预测肿瘤的复发，并且认为CD133可以作为某些肿瘤的预后指标。而对肝癌干细胞的研究表明CD133抗原可能是肝癌干细胞的表面标记物。
　　 鉴此，本研究以普外科常见病肝癌为研究对象，以肿瘤干细胞表面标记分子CD133为切入点，初步探讨CD133在肝癌临床标本的表达及其临床意义。
　　 本研究利用高质量的cDNA基因文库提供的模板，为克隆CD133全长基因提供了可靠的物质基础，采用PCR分段克隆重叠片段，从技术层面解决了此类长基因克隆的瓶颈。
　　 进而，本研究将CD133基因克隆入真核表达载体，转染小鼠成纤维细胞L929细胞，获得了基因工程细胞株L-CD133，这为进一步研究CD133的生物学功能提供了物质基础，同时，基因工程细胞株的构建也使CD133抗原胞外段的天然空间结构充分展示，获得了后续的抗人CD133单抗得研制过程关键的筛选抗原。
　　 鉴于与CD133相互作用的生物因子尚未被发现，利用特异性抗体刺激细胞膜表面分子是目前能用于激发CD133分子生物学功能的有效手段。然而目前国际上已有的抗CD133单抗中，尚无功能性CD133的报道。因此，本部分研究在克隆人CD133全长基因和建立其基因工程细胞株的基础上，进而研制抗人CD133单克隆抗体，具有重要的理论意义和应用价值。为了进一步深入探讨CD133分子在肿瘤干细胞的的表达和临床意义，获得探索诊断和治疗肿瘤的新手段，本研究以单核细胞性白血病细胞株U937细胞株免疫Balb/c小鼠，L-CD133基因工程细胞株为筛选抗原，采用B淋巴瘤杂交瘤技术，成功地建立了稳定分泌抗人CD133单克隆抗体(6B6)的杂交瘤细胞株，并分离纯化单克隆抗体和进行了单抗特性的初步鉴定。单抗6B6的识别谱与商品化抗人CD133单抗AC141类似，该抗体还可用于肠癌组织的免疫组织化学分析，在肠癌组织标本上检测到CD133抗原的表达。进而发现，单抗6B6可有效抑制CD133+肠癌细胞Caco-2的增殖。
　　 继而，本研究用自制鼠抗人CD133单克隆抗体6B6作为工具，以免疫组织化学为主要方法对CD133抗原在人肝癌组织中的表达情况进行系统的研究，并对其在肝癌组织中的表达同患者的主要临床病理特征之间的关系进行探讨。研究发现：单抗6B6可用于肝癌组织的免疫组织化学分析，可在肝癌组织标本上检测到CD133抗原的表达。且大部分标本阳性细胞比率<1％，一般不超过5％。这说明CD133+肝癌干细胞在整个肝癌组织中所占比例是比较低的。本研究发现CD133抗原的表达同患者的血清AFP水平、肝癌病理分化等级有显著相关性P　　 综上，我们获得了一株特异性抗人CD133单克隆抗体，在肿瘤临床诊断和免疫治疗中具有潜在应用价值。