φC31-att介导的家蚕/细胞转基因及基于GAL4/UAS双元系统控制蛹期发育

摘要

φC31的位点专一性重组系统能够有效地介导噬菌体attB位点和宿主attP位点之间的整合，本研究利用该系统构建转基因家蚕细胞和转基因家蚕。研究构建了pSK-attB/Pie1-EGFP/Zeo-PASV40供体质粒，其中φC31 attB位点下游具OpNPV的ie-1启动子驱动gfp-zeocin融合基因的表达盒；同时构建了一个包含φC31整合酶基因瞬时表达盒的辅助质粒pSK-Pie1/NLS-Int/NSL，其中两侧均带有核定位信号序列的φC31整合酶基因由BmNPV的ie-1启动子驱动。在共转染供体质粒和辅助质粒的家蚕培养细胞中可检测到gfp-zeocin融合基因的表达，反向PCR产物测序结果显示，φC31整合酶可以准确地识别和切割供体质粒上的attB位点，并介导attB位点和细胞内源性假attP位点之间的重组。同样，将供体质粒和辅助质粒通过精子介导法转入家蚕的卵中，通过绿色荧光筛选，结合gfp基因的PCR鉴定获得转基因家蚕，插入位点的傍侧序列分析结果显示，基于φC31的位点专一性重组系统可以将外源基因导入家蚕基因组。研究结果为家蚕遗传操作提供了新的途径和策略。
　　延长家蚕的蛹期有可能实现缫丝工艺的重大改革。为了通过GAL4/UAS双元系统在F1代蛹期特异性表达蜕皮甾醇尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因（egt），明显延缓蛹期发育，构建了效应系统载体piggyA3GFP-ie-neo-UAS-egt-polyA,（其中，egt基因由UAS控制表达）和激活系统载体piggyA3GFP-ie-neo-BmWCP4-Gal4-polyA（其中，gal4的表达由BmWCP4启动子控制）；两种载体均带有A3启动子控制的gfp和BmNPV ie-1启动子控制的neo。本实验室的前期研究已通过 piggyA3GFP-ie-neo-BmWCP4-Gal4-polyA介导，将BmWCP4-Gal4表达元件导入家蚕实用品种菁松，并筛选鉴定至G7代，此基础上，本研究进一步筛选、鉴定培育至G9代，获菁松BmWCP4-Gal4系统；通过精子介导法将piggyA3GFP-ie-neo-UAS-egt-polyA导入大造品种，通过荧光筛选、和分子生物学鉴定，获得了UAS-egt转基因家蚕，通过继代、鉴定培育至G4代，期望进一步继代筛选获得大造UAS-egt系统。进而将BmWCP4-Gal4系统和UAS-egt系统杂交，研究F1代蛹期特异性表达的egt基因对蛹期发育的影响。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 文献综述

1 位点专一性重组系统及其应用

2 同源重组

3 转座作用

4 家蚕的发育研究进展

参考文献

第二章 研究目的和研究内容

1 研究目的和意义

2 研究的主要过程

第三章 实验材料与方法

1 实验材料

2 常用仪器

3 实验方法

参考文献

第四章 φC31-att介导的家蚕/细胞转基因

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

第五章 基于GAL4/UAS双元系统控制蛹期发育

1 实验材料

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

结论

1 已取得的成果

2 有待进行的研究

资助项目

附录

附录三 硕士期间发表的论文

致谢