Parkin与OGCP相互作用研究及OGCP基因的突变检测

摘要

第一部分Parkin与OGCP相互作用研究 ParkSn基因是帕金森病的致病基因之一，Parkin蛋白作为泛素-蛋白酶体通路(UPP)的一种E3酶，介导了多种底物蛋白的泛素化过程，后者与帕金森病的发病机制有着密切的联系。α-酮戊二酸载体蛋白(OGCP)位于线粒体上。在本课题中，我们对Parkin与OGCP之间的相互作用进行研究。 应用PCR技术从人胎脑cDNA文库扩增全长的Parkin和OGCP基因的CDS，亚克隆至pCMV-Tag4和pcDNA3.l-myc-his(一)B表达载体，构建Parkin和OGCP的真核表达载体pCMV-Parkin和pcDNA3.1-myc-OGCP，经测序证实了载体构建正确。将pCMV-Parkin和pcDNh3.1-myc-OGCP转染到HEK293细胞中，用免疫印迹、免疫荧光和激光共聚焦显微镜等技术检测，发现pCMV-Parkin和pcDNA3.1-myc-OGCP能正确地表达出Parkin-Flag融合蛋白(54KD)和OGCP-myc融合蛋白(38KD)；Parkin-Flag融合蛋白分布在胞浆和胞核中，而OGCP-myc融合蛋白分布在胞浆中，定位在线粒体上；Flag和myc与Parkin和OGCP的融合并没有改变Parkin和OGCP的亚细胞定位。此外，还成功地建立了OGCP-myc稳定表达的HEK293细胞。 应用免疫荧光和激光共聚焦显微镜共定位技术，发现在共转DCMv-Parkin和pcDNA3.1myc-OGCP的HEK293细胞中，Parkin-Flag融合蛋白和OGCP-myc融合蛋白存在共定位；免疫共沉淀试验证实了Parkin-Flag融合蛋白和OGCP-myc融合蛋白存在相互作用。表明Parkin和OGCP是一对相互作用蛋白。 体外泛素化实验发现Parkin-Flag融合蛋白在E1酶、UbcH7和泛素存在的条件下，能介导OGCP-myc融合蛋白泛素化；体内泛素化实验也证明Parkin-Flag融合蛋白能介导OGCP-myc融合蛋白泛素化。表明OGCP是Parkin的底物蛋白，Parkin介导了OGCP的泛素化。 用特异的蛋白酶体抑制剂和蛋白酶抑制剂对OGCP-myc／HEK293细胞进行干预，发现这些抑制剂能减缓OGCP-myc融合蛋白的代谢和更新，提示蛋白酶体途径和溶酶体途径都参与了OGCP代谢。通过同位素<'35>S标记的脉冲追踪实验，发现OGCP-myc融合蛋白的代谢半衰期大约为8-10小时，Parkin-Flag融合蛋白能促进OGCP-myc融合蛋白的代谢和更新。表明Parkin能促进OGCP的代谢和更新。 第二部分帕金森病患者OGCP基因的突变检测 为了了解OGCP基因与帕金森病是否存在相关性，采用了变性高效液相色谱(DHPLC)突变检测技术，对120例散发性帕金森病患者和200名正常健康者的OGCP基因的8个外显子进行突变检测，未发现OGCP基因的致病突变和单核苷酸多态。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词

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前 言

第一部分Parkin与OGCP相互作用研究 第一章Parkin和OGCP真核表达载体的构建

第一部分Parkin与OGCP相互作用研究 第二章Parkin和OGCP真核表达载体的表达与检测

第一部分Parkin与OGCP相互作用研究 第三章Parkin与OGCP相互作用

第一部分Parkin与OGCP相互作用研究 第四章Parkin介导OGCP的泛素化修饰

第一部分Parkin与OGCP相互作用研究 第五章OGCP代谢途径与代谢速率分析

第二部分帕金森病患者OGCP基因的突变检测

结 论

参考文献

综述 Parkin蛋白和其相关蛋白研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文及科研成果