武昌罗索线虫和中华卵索线虫线粒体基因组多态性分析

摘要

昆虫病原索科线虫可广泛寄生于农、林及卫生害虫体内，其寄生率等于害虫死亡率，是一类宝贵的昆虫天敌资源，对保护环境和实现农田生物多样性具有重要的意义。 线粒体是存在于大多数真核细胞内，行使氧化磷酸化功能的重要细胞器。线粒体DNA（mtDNA）是双链核外遗传物质，在动物体内含量丰富，具有分子量小、分子进化速度快、结构基因保守性强等特性，被广泛应用于分子遗传进化、分类鉴定、发育生物学和变异与一些疾病的研究。 目前，国外已对地老虎六索线虫（Hexamermis agrotis）、多索线虫待定种BH-2006（Agamermis sp.BH-2006）、食蚊罗索线虫（Romanomermis culicivorax）、尼尔森里斯罗索线虫（R.nielsenni）、埃氏罗索线虫（R. iyengari）和Thaumamermis cosgrovei共6种索科线虫线粒体基因组进行了测序和研究，国内此领域还刚刚起步。为了完善索科线虫线粒体基因组全序列数据库，更系统的研究其线粒体基因组特征和系统演化规律，进而为提高线虫的生防潜力打下基础，本实验室首次在国内开展了索科线虫线粒体基因组的研究。 本实验将滚环复制和长PCR扩增技术结合起来，成功完成武昌罗索线虫（Romanomermis wuchangensis）和中华卵索线虫（Ovomermis sinensis）线粒体基因组全序列测序，并对后者存在种内遗传多态性的原因进行了探究。此外，通过与Genbank中已有的6种索科线虫线粒体基因组序列进行对比，概括了索科线虫线粒体基因组的基本特点，并进行了分析。现将以上研究结果报道如下。 1、武昌罗索线虫线粒体基因组经滚环复制、酶切和琼脂糖凝胶电泳，其图谱显示各单体的线粒体基因组酶切条带一致，其大小基本相同，总长大约为15kb。之后对1条线虫进行两步长PCR扩增，测序拼接得到其线粒体基因组全序列，总长为14832bp，与酶切图谱一致。其线粒体基因组包括12个（12种）蛋白质编码基因、2个rRNA基因、23个tRNA基因和一段富含AT的D-loop区。 2、中华卵索线虫线粒体基因组经滚环复制、酶切和琼脂糖凝胶电泳，其图谱显示每条单体的线粒体基因组酶切片段均表现出特异性，总长变化较大，为16.5～24.5kb，表明中华卵索线虫线粒体基因组存在种内的遗传多态性。在1条中华卵索线虫线粒体基因组全序列成功测序的基础上，本实验采用多步长PCR（四步长）对另一条代表性线虫序列进行了扩增和测序，拼接得到其线粒体基因组全序列，总长为16777 bp，与酶切图谱一致。其线粒体基因组包括13个（12种）蛋白质编码基因、2个rRNA基因、20个tRNA基因和一段富含AT的D-loop区。 3、通过2条中华卵索线虫线粒体基因组全序列对比，对其多态性及产生的原因进行了探讨。其多态性主要由线粒体基因组中的可变部分造成，在这一部分中存在基因排列顺序的不同和基因重复现象。我们引用了倍增.随机删除模型和线粒体基因的重排机制对其进行了合理的解释。序列倍增和分子内、分子间的重组作用是中华卵索线虫线粒体基因组多态性产生的最可能的原因。 4、通过与Genbank中已有的6种索科线虫线粒体基因组序列对比，概括出索科线虫线粒体基因组具有以下特点：①线粒体基因排列顺序各不相同；②部分线虫线粒体基因存在重复现象，且重复次数不同；③线粒体长度存在很大差异。 综上，本实验通过滚环复制和长PCR扩增技术相结合的方法，成功完成1条武昌罗索线虫和1条中华卵索线虫线粒体基因组全序列测序，并对中华卵索线虫线粒体基因组种内多态性进行了探讨。通过与Genbank中已有的6种索科线虫线粒体基因组序列进行对比，概括了索科线虫线粒体基因组的基本特点，并对其进行了分析。积累了研究索科线虫线粒体基因组全序列的宝贵方法和理论经验，对进一步全面开展我国索科线虫线粒体基因组研究提供了一定的参考资料。

目录

文摘

英文文摘

声明

1.文献综述

1.1索科线虫简介

1.1.1武昌罗索线虫

1.1.2中华卵索线虫

1.2线虫线粒体基因组的特点

1.2.1线虫线粒体基因组的结构特点

1.2.2线虫线粒体基因组的分子生物学特点

1.2.3线虫线粒体基因的遗传学特点

1.3线虫线粒体基因组的研究概况

1.3.1研究进展

1.3.2研究方法

1.4线虫线粒体基因组的研究意义

1.4.1线粒体基因组的进化

1.4.2线粒体基因组的突变与疾病、细胞衰老和细胞凋亡

1.4.3线粒体基因组在线虫种类鉴定和分子分类学方面的应用

1.4.4线粒体基因组在线虫系统发育研究中的应用

1.4.5线粒体基因组在研究线虫群体遗传中的应用

1.5本研究的背景及意义

2.材料与方法

2.1实验材料

2.1.1线虫的来源和培养

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.2实验方法

2.2.1实验方案

2.2.2滚环复制环形模板的提取

2.2.3基因组DNA的提取

2.2.4滚环复制

2.2.5酶切

2.2.6长PCR扩增的引物设计

2.2.7长PCR扩增

2.2.8测序及序列拼接

2.2.9测序结果分析

3. 结果与分析

3.1武昌罗索线虫线粒体基因组

3.1.1滚环复制、酶切和琼脂糖凝胶电泳结果

3.1.2长PCR扩增结果

3.1.3长PCR扩增片段的测序结果

3.1.4测序结果及分析

3.2中华卵索线虫线粒体基因组

3.2.1滚环复制、酶切和琼脂糖凝胶电泳结果

3.2.2长PCR扩增结果

3.2.3长PCR扩增片段的测序结果

3.2.4测序结果及分析

3.2.5中华卵索线虫线粒体基因组多态性及分析

3.3索科线虫线粒体基因组特点分析

4.讨论

4.1实验线虫的培养与线粒体基因组提取方法探究

4.2长PCR方法的应用及注意事项

4.3滚环复制、酶切和琼脂糖凝胶电泳结果分析

4.4结语

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢