中华卵索线虫和武昌罗索线虫线粒体基因组的研究

摘要

昆虫病原索科线虫是一类宝贵的昆虫天敌资源，对农、林及卫生害虫的综合治理、环境保护以及实现农田生物多样性，都具有重要的学术和实用价值。线粒体是绝大多数真核生物细胞氧化供能的主要细胞器。由于线粒体基因组自身结构的特点，它已经作为分子标记被广泛应用，研究线虫线粒体全基因组对研究其系统发育、种类鉴定、分子分类，以及线粒体突变相关疾病和细胞衰老、细胞凋亡等方面具有重要意义。 目前，国外仅对6种索科线虫(Romanomermis culicivorax、R．iyengari、R．nielseni、Thaumamermis cosgrovci、Agamermis sp.、Hexamermis agrotis)线粒体全基因组进行了研究，国内此领域还属空白。为全面展开我国索科线虫线粒体比较基因组学研究，本文首次在国内对中华卵索线虫(Ovomermis sinensis)和武昌罗索线虫(R．wuchangensis)线粒体全基因组进行了研究。现将结果报道如下。 1、在研究方法上，首次将滚环复制和两步长PCR扩增结合起来，建立了一套研究线粒体全基因组的新方法。首先利用滚环复制方法验证线虫线粒体基因组是否具有遗传多态性(是否存在大量的重复序列)。对存在遗传多态性的线虫，将其单条线虫个体分切成1／3和2／3两部分，1／3部分用来做滚环复制以确定mtDNA的大小，另2／3部分用来做长PCR扩增以进行序列测定，扩增时设计引物的区域要尽量避免使用存在重复的基因，并利用两个重叠的片段高效率的扩增出线粒体基因组的全长，最后利用步行法直接测序得出序列全长，该方法既能准确的测出线粒体基因组的大小，并能在此基础上快速扩增出线粒体基因组的全序列片段，避免了使用多个片段来拼接的繁琐工作，也避免了引物设计在存在重复基因区域时带来的非特异性扩增，是一种研究存在大量重复序列线粒体基因组的简单、快速、有效方法。对于不存在遗传多态性的线虫，直接提取基因组DNA，两步长PCR扩增得到线粒体基因组全长片段，测序拼接得到全长序列。 2、利用上述方法对中华卵索线虫的线粒体基因组进行了研究。滚环复制结果显示，中华卵索线虫线粒体全基因组存在种内的遗传多样性，它的线粒体基因组的大小在13-30kb之间，就本研究选用的3条线虫，其每条线虫的线粒体基因组全长都存在差异；通过两步长PCR扩增得到了一条中华卵索线虫线粒体全基因组序列的两个片段，大小分别为约7kb和约12kb，测序结果拼接后，得出此条中华卵索线虫的线粒体基因组全长为18864bp。 通过软件分析得出其碱基含量为A7498个、T7219个、G2070个、C2077个，A％>T％>C％>G％，T％+A％(78.02％)>C％+G％(21.98％)，表现出明显的AT的相对丰富，对其基因组成进行分析得出其包含15个(12种)蛋白质基因(其中含有4个ND3的串联重复)，2个rRNA基因，23个tRNA基因和一个非编码区。 3、利用同样的方法对武昌罗索线虫的线粒体基因组进行了研究。滚环复制结果显示，武昌罗索线虫线粒体全基因组不存在种内的遗传多样性，即每条线虫大小都相同。通过两步长PCR扩增，得到两个片段大小分别为约5kb和10kb，推测其基因组大小在15kb左右。目前，约5kb大小片段的测序工作已完成，10kb大小的片段己测出4kb，其余部分的测序工作正在进行中。对已测出的片段的基因序列进行拼接，结果显示：已测出的武昌罗索线虫线粒体基因组长8445bp，通过软件分析得出其碱基含量为A：3824个、T：3088个、G：721个、C：811个，A％：45.28、T％：36.57、G％：8.54、C％：9.60，对其基因组成进行分析得出其包括7个蛋白质基因，2个rRNA基因，6个tRNA基因。 4、以ATPase6和COXⅡ基因为数据集对6种已测序的索科线虫和本实验中得到的中华卵索线虫以及武昌罗索线虫构建系统树，结果显示：基于两种基因构建的系统进化树表现出一致性，即罗索属的R．nielsenni；R．culicivora；R．wuchangensis和R．iyengari聚在一起形成第一大类群，H agrotis；Agamermis sp．先聚在一起再与Ovomermis sinensi聚在一起形成第二大类群，最后再与T．cosgrovci聚在一起。 采用改进了的滚环复制和两步长PCR扩增相结合的方法，证实了中华卵索线虫存在线粒体基因组遗传多念性、武昌罗索线虫不存在线粒体基因组遗传多态性，并扩增得到了中华卵索线虫其中一条的线粒体全基因组序列和武昌罗索线虫基因组的部分序列。本研究工作为全面、迅速而有效地展开对其它索科线虫线粒体基因组研究奠定了理论和方法基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1.文献综述

1.1线虫线粒体基因组的特点

1.1.1线虫线粒体基因组的结构特点

1.1.2线虫线粒体基因组的分子生物学特性

1.1.3线虫线粒体基因的遗传特征

1.2线虫线粒体基因组的研究概况

1.2.1研究进展

1.2.2研究方法

1.3滚环复制及其在线虫线粒体基因组研究中的应用

1.3.1 RCA的原理

1.3.2 RCA在线虫线粒体基因组研究中的应用

1.4线虫线粒体基因组的研究意义

1.4.1线粒体基因组的进化

1.4.2线粒体基因组在线虫种类鉴定以及分子分类学方面的应用

1.4.3线粒体基因组在线虫系统发育研究中的应用

1.5本研究的研究背景及意义

2.材料与方法

2.1实验材料

2.1.1线虫的来源

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.2实验方法

2.2.1实验设计

2.2.2滚环复制环形模板的提取

2.2.3基因组DNA的提取

2.2.4滚环复制

2.2.5滚环复制后酶切

2.2.6长PCR扩增的引物设计

2.2.7长PCR扩增

2.2.8测序

2.2.9测序结果分析

3.结果与分析

3.1中华卵索线虫线粒体基因组实验结果

3.1.1 RCA结果

3.1.2长PCR扩增结果

3.1.3长PCR扩增片段的测序结果

3.1.4测序结果及分析

3.2武昌罗索线虫线粒体基因组实验结果

3.2.1 RCA结果

3.2.2长PCR扩增结果

3.2.3长PCR扩增片段的测序结果

3.2.4测序结果及分析

3.3基于ATPase6和COXⅡ基因的系统树构建及分析

4.讨论

4.1关于存在线粒体基因组遗传多态性的RCA结果

4.2线粒体全基因组的研究方法探究

4.3长PCR模板的提取方法探讨

4.4扩增线虫线粒体基因组的引物设计原则

4.5关于线粒体基因重排的机制

4.6结语

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢