禽流感病毒感染的快速鉴别诊断试纸的应用研究

摘要

本研究针对目前禽流感感染检测方法中存在的问题，利用本实验室已建立的可区分免疫鸡群与野毒感染鸡群的快速鉴别诊断方法，通过对各种成分及实验条件的优化，组装成禽流感病毒感染的快速鉴别诊断试剂盒，对人工感染鸡血清和临床送检血清进行了较大规模的应用研究，取得了如下研究成果：
　　 1．禽流感病毒非结构蛋白（NS1）原核表达条件的筛选和各种反应条件的优化
　　 结果pKG-NS1在28℃条件下诱导6h后表达量最佳。Western-blot证实重组蛋白具有较好的免疫学活性。经GST标签蛋白亲和层析纯化，我们获得高纯度的表达蛋白，浓度为1.38mg/mL。确立了胶体金标记条件：最佳标记pH值为8.0，最佳标记量为10μg抗鸡IgG Fc单克隆抗体/mL胶体金。
　　 2．禽流感野毒感染快速鉴别诊断试剂盒的研制
　　 在禽流感NS1抗体鉴别诊断试纸条研制成功的基础上，我们组装了禽流感NS1抗体鉴别诊断试剂盒，试剂盒的保存期试验表明：试剂盒在4℃条件下保存4个月，检测其特异性和敏感度无明显变化；试剂盒在室温条件下保存2个月，检测其特异性和敏感度也无明显变化。说明试剂盒在4℃能够至少保存4个月以上。
　　 3．禽流感病毒人工感染后NS抗体的产生和消长规律研究
　　 肉鸡感染后第3d开始检测出NS1抗体，至11d阳性率达89％，然后快速下降，21d检出率下降至10％，26天后完全消失，NS1抗体阳性率高低与感染鸡发病及死亡率高低明显一致。而对照组和灭活疫苗免疫组NS1抗体检测呈阴性。感染组HI抗体消长规律基本一致。通过肉鸡人工感染实验，我们首次揭示了禽流感感染后肉鸡体内NS1抗体消长情况，同时也证实本研究室研制的AIV-NS1抗体检测试纸条可以从患有呼吸道感染的病鸡中快速诊断出禽流感感染。
　　 4．禽流感野毒感染快速鉴别诊断试剂盒的应用研究
　　 来自豫鄂两省21个鸡场和实验室送检样品共970份免疫鸡的临床血清样品血清学检测结果中，GICA法检测阳性率为18.8％，禽流感H5 HI试验检出率为73.4％，禽流感H9 HI试验检出率为30.9％；GICA法检测为阳性的样品，禽流感H5或H9HI试验均呈阳性。这说明国内存在H5和H9禽流感混合感染或免疫后再感染的情况。
　　 禽流感病毒感染的快速鉴别诊断试剂盒具有操作简单、快速，结果易于判断，不需要专业人员操作，适合在设备和技术条件差的基层具有很广泛应用前景。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

第1章文献综述

1禽流感研究进展

1.1病原

1.2当前我国禽流感流行的新动态

1.3禽流感的流行与危害

2禽流感检测方法研究进展

2.1病毒分离及鉴定

2.2血清学检测

3 NS1蛋白的研究进展

3.1NS1蛋白的分群及进化分析

3.2 NS1蛋白的结构

3.3 NS1蛋白在禽流感鉴别诊断上的应用

4胶体金免疫层析试纸条的结构和检测基本原理

5胶体金免疫层析技术的应用

6研究目的与意义

第2章禽流感病毒感染的快速鉴别诊断试纸的研制及临床应用

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1禽流感病毒NS1蛋白的表达条件优化结果

2.2免疫学活性检测结果

2.3蛋白浓度的测定

2.4抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的最适标记胶体金pH值

2.5抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的最适标记量的确定

2.6封闭液的选择

2.7检测线和质控线包被物浓度的选择

2.8试纸条特异性试验

2.9试纸条敏感性试验

2.10试纸条的重复性试验和保存期试验

2.11H9亚型禽流感病毒感染肉鸡体内NSl特异性抗体的消长规律

2.12试剂盒的临床应用

3讨论

3.1NS1蛋白的表达与纯化

3.2血清样品稀释倍数的确定

3.3 H9禽流感病毒人工感染肉鸡的血清样品中NS1抗体差异

3.4当前禽流感临床发病的特点

4结论

参考文献

研究生期间发表的主要论文

致谢