黏蛋白基因MUC5AC在支气管哮喘小鼠和人气道上皮细胞的表达及调控机制研究

摘要

气道杯状细胞增生(GCH)是支气管哮喘(以下简称哮喘)的重要病理特征，并伴随着储存和所分泌的黏蛋白(MUC)的变化，从而导致哮喘患者痰液产生、气道狭窄、症状发作和肺功能急剧下降等。研究已经发现，CD4+T细胞和Th2型细胞因子是GCH的重要介质，MUC5AC则是表达在气道杯状细胞上的主要MUC基因，但细胞因子所诱导的GCH的机制、MUC基因上调与GCH的关系以及新近发现的“钙激活的氯通道”在其中的作用目前尚不清楚，因此，本研究应用分子生物学技术和方法，通过系统探讨MUC5AC基因在哮喘小鼠气道和正常人气道上皮细胞的表达及分子调控机制以及糖皮质激素的治疗作用，以期为哮喘临床治疗提供新的靶点。 第一部分Gob-5对哮喘小鼠气道MUC5AC表达的调控作用研究 分题一Gob-5在哮喘小鼠气道的表达及与MUC5AC关系的研究 目的：研究“钙激活的氯通道”基因家族的小鼠成员gob-5在哮喘小鼠气道的表达及与MUC5AC和黏液分泌的关系。 方法：16只BALB/c小鼠分为对照组和哮喘组，观察BALF细胞计数、肺组织病理和气道杯状细胞改变，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学染色分别检测气道gob-5和白细胞介素(IL)-4mRNA以及MUC5AC蛋白。 结果：与对照组相比，哮喘组肺组织和BALF中嗜酸性粒细胞以及气道杯状细胞均明显增多；哮喘组气道gob-5、IL-4mRNA和MUC5AC蛋白(分别为0.2297±0.0559、0.6536±0.0797和0.6637±0.0663)较对照组(分别为0、0.2317±0.0373和0.2060±0.0736)均明显增加(P均＜0.01)；哮喘组气道gob-5mRNA与MUC5AC蛋白之间呈直线正相关(r=0.864，P＜0.01)。 结论：Gob-5在促进哮喘小鼠气道MUC5AC表达和黏液过度分泌中可能起重要作用，Th2型细胞因子IL-4可能是该通道合成和选择性表达的刺激因子，抑制该通道将为哮喘治疗提供新的策略。 分题二Gob-5反义寡核苷酸对哮喘小鼠气道MUC5AC表达的作用 目的：探讨gob-5反义寡核苷酸对哮喘小鼠气道MUC5AC表达的作用。方法：32只BALB/c小鼠分为哮喘组、gob-5反义寡核苷酸组(ASODN组)、gob-5正义寡核营酸组(SODN组)和对照组，进行BALF细胞计数，用RT-PCR、免疫组织化学染色和Westernblot分别检测气道gob-5mRNA和MUC5AC蛋白。 结果：ASODN组BALF嗜酸性粒细胞数较哮喘组明显减少。哮喘组气道gob-5mRNA和MUC5AC蛋白(分别为0.2502±0.0401和0.7246±0.1036)均较对照组(分别为0和0.2478±0.0423)明显增加(P均＜0.01)；ASODN组(分别为0.0004±0.0003和0.2487±0.0413)较哮喘组均明显降低(P均＜0.05)，且和对照组相比差异无显著性(P＞0.05)；SODN组(分别为0.2499±0.0402和0.5700±0.2007)和哮喘组相比差异均无显著性(P均＞0.05)，和对照组相比均明显增高(P分别＜0.01、0.05)，和ASODN组相比也均明显增高(P均＜0.01)。哮喘组和ASODN组气道gob-5mRNA与MUC5AC蛋白之间均呈直线正相关(r分别=0.973、0.966，P均＜0.01)。 结论：Gob-5反义寡核苷酸可有效抑制哮喘小鼠气道MUC5AC表达，阻断gob-5可能对哮喘气道黏液过度分泌具有治疗作用。 第二部分IL-13对哮喘小鼠气道MUC5AC表达作用机制的研究分题一IL-13对哮喘小鼠气道gob-5及MUC5AC表达的作用 目的：研究IL-13对哮喘小鼠气道gob-5和MUC5AC表达的影响及其在气道黏液分泌中的作用。 方法：45只BALB/c小鼠分为对照组、哮喘组和IL-13组，用RT-PCR、免疫组织化学染色和Westernblot分别检测气道gob-5mRNA、MUC5ACmRNA和蛋白。结果：哮喘组气道gob-5mRNA(1.136±0.007)较对照组(0)明显增加(P＜0.01)，IL-13组(1.246±0.008)较对照组和哮喘组也均明显增加(P均＜0.01)；哮喘组气道MUC5ACmRNA和蛋白(分别为0.161±0.011和7只小鼠阳性)较对照组(分别为0.070±0.004和2只小鼠阳性)明显增加(P分别＜0.01、0.05)，IL-13组(分别为0.250±0.014和13只小鼠阳性)较对照组和哮喘组也均明显增加(两组P分别＜0.01、0.01和0.01、0.05)；哮喘组和IL-13组气道gob-5mRNA与MUC5ACmRNA之间均呈直线正相关(r分别=0.986、0.961，P均＜0.01)。 结论：Gob-5是促进哮喘小鼠气道MUC5AC表达和气道黏液过度分泌的重要基因，其机制可能是由于Th2型细胞因子IL-13的诱导作用。 分题二IL-13对哮喘小鼠气道MUC5AC及Bcl-2、Bax表达的作用 目的：研究IL-13对哮喘小鼠气道MUC5AC、Bcl-2和Bax表达的作用，探讨气道黏液过度分泌的机制。 方法：24只BALB/c小鼠分为对照组、哮喘组和IL-13组，观察肺组织病理改变，用RT-PCR、免疫组织化学染色和Westernblot分别检测气道MUC5ACmRNA和蛋白、Bcl-2以及Bax蛋白。 结果：(略） 结论：IL-13是引起哮喘小鼠气道MUC5AC表达和黏液过度分泌的重要细胞因子，凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax在其中可能起着重要作用。 第三部分糖皮质激素对哮喘小鼠气道MUC5AC表达作用的研究 目的：研究糖皮质激素对哮喘小鼠气道MUC5AC表达的影响，探讨其对气道黏液过度分泌的可能作用机制。 方法：24只BALB/c小鼠分为对照组、哮喘组和地塞米松组，观察BALF细胞计数和气道杯状细胞变化，用RT-PCR和免疫组织化学染色分别检测气道MUC5ACmRNA和蛋白、IL-4mRNA。 结果：与对照组相比，哮喘组BALF嗜酸性粒细胞和气道杯状细胞均明显增多，而地塞米松组处理后明显减少；哮喘组气道MUC5ACmRNA和蛋白以及IL-4mRNA(分别为0.5341±0.0303、0.1905±0.0008和0.6265±0.0932)均较对照组(分别为0.1994±0.0128、0.1194±0.0007和0.2389±0.0289)明显增加(P均＜0.01)，地塞米松组(分别为0.2729±0.0345、0.1456±0.0003和0.2424±0.0260)又较哮喘组均明显降低(P分别＜0.05、0.01、0.01)，但地塞米松组IL-4mRNA和对照组相比差异无显著性(P＞0.05)，MUC5ACmRNA和蛋白和对照组相比均明显降低(P均＜0.01)。 结论：糖皮质激素可减轻哮喘小鼠肺组织炎症，并可能通过下调MUC5AC和IL-4表达在气道黏液过度分泌中起治疗作用。 第四部分尼氟灭酸和糖皮质激素对IL-13诱导的人气道上皮细胞hCLCA1表达的作用及与MUC5AC表达关系的研究 目的：研究尼氟灭酸和糖皮质激素对IL-13诱导的人气道上皮细胞hCLCA1表达的作用及与MUC5AC表达的关系，探讨对它们气道黏液分泌的作用和机制。方法：培养人气道上皮细胞株HBE4，IL-13诱导其表达hCLCA1mRNA后以尼氟灭酸和地塞米松分别处理48h，RT-PCR、免疫细胞化学染色和Westernblot分别检测气道hCLCA1mRNA、MUC5ACmRNA和蛋白。 结果：IL-13刺激HBE4细胞5d时可以诱导其表达hCLCA1mRNA；IL-13组hCLCA1mRNA(0.5354±0.0958)明显高于对照组(0)(P＜0.01)，尼氟灭酸组(0.2775±0.0534)明显低于IL-13组(P＜0.01)，地塞米松组(0.5191±0.1021)和IL-13组差异无显著性(P＞0.05)；IL-13组MUC5ACmRNA和蛋白(分别为0.6381±0.1607和3.7525±0.3591)明显高于对照组(0.0920±0.0216和0.7731±0.1613)(P均＜0.01)，尼氟灭酸组(0.3582±0.0807和1.3606±0.1660)和地塞米松组(0.3785±0.0523和1.3512±0.1439)均明显低于IL-13组(P均＜0.01)。相关分析表明，IL-13组hCLCA1与MUC5ACmRNA之间呈直线正相关(r=0.906，P＜0.01)。 结论：尼氟灭酸可阻断HBE4细胞hCLCA1和MUC5AC表达，而糖皮质激素仅可下调MUC5AC，这可能是后者对哮喘气道黏液分泌治疗作用有限的原因之一。

目录

论文说明：论文缩略语

第一部分Gob-5对哮喘小鼠气道MUC5AC表达的调控作用研究

分题一Gob-5在哮喘小鼠气道的表达及与MUC5AC关系的研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

分题二Gob-5反义寡核苷酸对哮喘小鼠气道MUC5AC表达的作用

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

第二部分IL-13对哮喘小鼠气道MUC5AC表达作用机制的研究

分题一IL-13对哮喘小鼠气道gob-5及MUC5AC表达的作用

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

分题二IL-13对哮喘小鼠气道MUC5AC及Bcl-2、Bax表达的作用

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

第三部分糖皮质激素对哮喘小鼠气道MUC5AC表达作用的研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

第四部分尼氟灭酸和糖皮质激素对IL-13诱导的人气道上皮细胞hCLCA1表达的作用及与MUC5AC表达关系的研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

综述一杯状细胞和黏蛋白基因异常与支气管哮喘研究进展

综述二“钙激活的氯通道”与支气管哮喘气道黏液过度分泌

附录 论文发表情况

致谢