低共熔溶剂(DESs)中鳕鱼皮胶原蛋白肽的分离纯化研究

摘要

近年来，胶原蛋白肽由于具有重要的生物学功能引起了人们极大的关注。传统胶原蛋白肽的提取方法主要为两部分，即明胶的获得和酶解。但因其存在提取率低，工艺复杂、耗时长等的不足，需要对其进一步地改进和提高。低共熔溶剂是一种新型的可持续发展的绿色溶剂，具有无毒、可生物降解、原子利用率达到100%等优点，目前已被广泛应用于各种化工领域。基于其在天然产物中分离提取的有效应用，本文提出了一种用低共熔溶剂(DESs）高效高纯度地从鳕鱼皮中提取不同分子量胶原蛋白肽的方法。
　　首先，本文以氯化胆碱为氢键受体，尿素、乙二醇、甘油、酸 A、酸 B和酸C等为氢键供体制备了一系列的DESs，并将其用于鳕鱼皮的浸出体系探究。研究表明，氯化胆碱/尿素中几乎无胶原蛋白的浸出。将由其它体系得到的鱼皮浸出液用有机溶剂沉淀法纯化胶原蛋白及多肽，并通过 UV、HPLC和SDS-PAGE的方法对所得的产物进行纯度和分子量测定。研究表明， DESs酸性体系可以获得较高纯度的目标物。其中，氯化胆碱/酸 A、氯化胆碱/酸 B体系所得分子量主要在100 KDa以上，得率较低。氯化胆碱/酸C体系所得分子量在11 KDa以下，且得率较高。因此，选择的最佳体系为氯化胆碱/酸C。
　　对筛选出的氯化胆碱/酸C体系进行单因素实验，探究其不同摩尔比、反应温度、反应时间及液固比对胶原蛋白肽得率及纯度的影响，从而确定出响应面法所需的因素和水平。采用Box-Behnken中3因素3水平的方法，对不同分子量胶原蛋白肽的提取工艺条件进行优化。研究表明，大分子胶原蛋白肽的最佳提取工艺为：摩尔比1:1.0；温度为65oC，时间为2.2 h，液固比为80:1（mL/g），相应的得率和纯度分别为：91.57%和92.85%；小分子胶原蛋白肽的最佳工艺条件为：摩尔比为1:1.0；温度为66oC，时间为6 h，液固比为120:1（mL/g），相应的得率和纯度分别为：96.36%和100%。
　　最后，采用 UV和 FTIR的方法，对 DESs的中性及酸性体系进行浸出机理研究。研究表明，DESs中性体系中的Cl-会与胶原蛋白肽末端的氨基或羧基通过氢键作用结合，从而促进了胶原蛋白肽的溶解；DESs酸性体系中游离的氢离子会与胶原蛋白中的亚氨基特异性结合，因而所得产物的纯度较高。此外， DESs酸性体系与胶原蛋白之间形成的新DESs也会促进胶原蛋白的浸出。

目录

第1章 绪 论

1.1 课题背景及研究的目的和意义

1.2 胶原蛋白概述

1.3 胶原蛋白肽的国内外研究现状

1.4 胶原蛋白肽的应用

1.5 低共熔溶剂

1.6 本文研究的主要内容

第2章 试验原料与测试方法

2.1 试验试剂

2.2 试验仪器

2.3 试验流程

2.4 分析方法

2.5 本章小结

第3章 DESs提取胶原多肽的体系研究

3.1 DESs体系的制备

3.2 DESs介质中鳕鱼皮的浸出研究

3.3 DESs浸出体系中产物的分离纯化研究

3.4 DESs酸性体系中胶原多肽的HPLC分析

3.5 DESs酸性体系中胶原多肽的SDS-PAGE分析

3.6 本章小结

第4章 鳕鱼皮胶原蛋白肽的提取工艺优化

4.1 鳕鱼皮胶原蛋白肽的提取工艺

4.2 单因素试验探究

4.3 响应面法优化提取工艺

4.4 本章小结

第5章 胶原蛋白肽的浸出机理研究

5.1 DESs中性体系胶原蛋白肽的浸出机理

5.2 DESs酸性体系胶原蛋白肽的浸出机理

5.3 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果

声明

致谢