2-甲氧基雌二醇对EC109紫杉醇耐药株体外细胞毒性机制的研究

摘要

根据全球癌症的相关数据显示，食管癌是全球范围内十大最常见的恶性肿瘤之一，其致死率居第六位。我国是食管癌的高发区，食管癌在我国是致死率最高的肿瘤之一，这与抗肿瘤药物治疗的失败密切相关。紫杉醇是治疗食管癌的常用药物，而食管癌患者对紫杉醇这一抗癌药物产生耐药性是导致化疗失败的最主要的因素。
　　DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferases, DNMTs）的作用下，将S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）自身的甲基转移到胞嘧啶的第5位碳原子上，从而形成5-甲基胞嘧啶（5mC）的现象。最近研究发现DNMTs的异常激活与人类多种恶性肿瘤耐药现象的的产生密切相关，其中包括食管癌耐药，这也为食管癌 EC109的紫杉醇耐药机制的研究提供了新的方向和思路。因此，本文采用了一种新型的抗肿瘤药物2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol,2-ME），通过抑制DNMTs的活性来提高食管癌EC109的紫杉醇耐药株(EC109/Taxol)的细胞毒性。
　　1、2-ME对EC109/Taxol及其亲本细胞的细胞毒性及细胞周期的影响
　　采用MTT法考察系列浓度（0.5，1，2，5，10μmol/L）2-ME对EC109/Taxol及其亲本细胞的细胞毒性的影响，对两个细胞株均作用24 h，48 h和72 h后，检测490nm处的吸光度并计算其IC50值。在倒置显微镜下观察2-ME作用前后， EC109/Taxol及其亲本细胞在形态学上的改变。随后，通过流式细胞术定量测定2-ME对 EC109/Taxol及其亲本细胞的细胞周期的变化，实验数据显示， EC109/Taxol及其亲本细胞经过不同浓度的2-ME作用后，具有时间和浓度依赖性。计算得出EC109/Taxol及其亲本细胞72 h的IC50值分别为2.04μmol/L和5.38μmol/L。细胞周期分布测定结果表明，溶剂对照组的 EC109/Taxol细胞与其亲本细胞相比，G0/G1和S期所占比例明显增大，G2/M期所占比例明显减少。与溶剂对照组相比，2-ME作用于EC109/Taxol及其亲本细胞24 h后，实验组细胞处于G2/M期的比例明显升高，且EC109/Taxol细胞G2/M期的比例升高的幅度远远大于其亲本细胞。该实验结果显示：2-ME对EC109/Taxol细胞具有更强的细胞毒性。
　　2、2-ME对EC109/Taxol及其亲本细胞的细胞凋亡的影响
　　采用流式细胞仪 Annexin V-FITC/PI双标法定量检测细胞凋亡率，为了进一步证实2-ME诱导 EC109/Taxol及其亲本细胞的细胞凋亡的情况，本文采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 DNA片段化。流式细胞仪定量检测细胞凋亡的结果显示：随着2-ME浓度的增大，早期凋亡率和晚期凋亡率均有不同程度的增加。最大浓度10μmol/L2-ME作用于细胞24 h后，EC109/Taxol及其亲本细胞的凋亡率分别为10.7±1.01％和20.5±0.96%。聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果显示：阴性对照组 EC109/Taxol及其亲本细胞的 DNA靠近加样孔，且显示有完整的基因组DNA，而不同浓度（2，5，10μmol/L）2-ME处理24 h后经聚丙烯酰胺凝胶电泳，发现10μmol/L2-ME实验组的聚丙烯酰胺凝胶电泳180-200 bp的整数倍处出现了凋亡细胞所特有的DNA ladder条带，且EC109/Taxol细胞组比其亲本细胞组更为明显。然而，在这两个细胞株中2，5μmol/L2-ME实验组的DNA ladder条带却很微弱。该项实验结果表明：2-ME能够更好地诱导EC109/Taxol细胞的凋亡。
　　3、2-ME对EC109/Taxol及其亲本细胞的DNMTs活性的影响
　　为了检测系列浓度（2，5，10μmol/L）2-ME对EC109/Taxol及其亲本细胞DNMTs活性的作用，本文采用 DNMTs的抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷（5-aza-deoxycytidine,5-Aza-dC）作为阳性对照，作用48 h后，提取核蛋白，通过DNMTs活性测定试剂盒进行检测。实验结果显示：随着2-ME药物浓度的增加，核蛋白的提取量明显减少，且在同一浓度下，EC109/Taxol细胞组比其亲本细胞组的核蛋白提取量更少。另外，经过DNMTs活性测定试剂盒进行检测，随着2-ME药物浓度的增加，DNMTs活性显著降低，且呈浓度依赖性。在10μmol/L的2-ME和5-Aza-dC的作用下，EC109/Taxol细胞的 DNMTs活性分别为：60.24±3.14%和48.31±1.23%。由此可见，2-ME对DNMTs的活性具有一定的抑制作用。
　　4、2-ME对EC109/Taxol及其亲本细胞的DNMT1和ABC转运蛋白超家族中耐药蛋白表达的影响
　　Western-Blot法检测2-ME作用于 EC109/Taxol及其亲本细胞48 h后， DNMT1和ABC转运蛋白超家族的耐药蛋白 P-gp，BCRP，MRP1的表达情况。通过2，5，10μmol/L的2-ME作用EC109/Taxol及其亲本细胞48 h后，DNMT1蛋白及P-gp，BCRP，MRP1蛋白的表达水平均明显下调。

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英文缩略词表

前言

第一章 2-ME对EC109/Taxol及其亲本细胞的细胞毒性及周期的影响

1 引言

2 实验材料

3 实验方法

4 实验结果与讨论

5 本章小结

第二章 2-ME对EC109/Taxol及其亲本细胞的细胞凋亡的影响

1 引言

2 实验材料

3 实验方法

4 实验结果与讨论

5 本章小结

第三章 2-ME对EC109/Taxol及其亲本细胞的DNA甲基化转移酶活性的影响

1 引言

2 实验材料

3 实验方法

4 实验结果与讨论

5 本章小结

第四章 Western blot检测2-ME对DNMT1及耐药相关蛋白表达的影响

1 引言

2 实验材料

3 实验方法

4 实验结果与讨论

5 本章小结

全文总结

参考文献

综述: 食管癌耐药机制的研究

1 DNA甲基化

2 ABC转运蛋白

3 针对食管癌EC109紫杉醇耐药株的研究

参考文献

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