舌癌Tca-83细胞培养上清对树突状细胞表型及功能影响的研究

摘要

目的：近年来，树突状细胞(dendritic cells，DC)已成为生物医学界肿瘤生物免疫治疗十分关注的研究热点。DC是目前发现的功能最强大的抗原提呈细胞(antigen-presenting cell，APC)，它是启动、调控及维持免疫应答的中心环节，对维持正常机体免疫系统自稳态起重要作用，在机体的抗肿瘤免疫应答中处于核心地位。诸多研究证实，DC能在体外摄取肿瘤抗原，并在体内激活初始T淋巴细胞产生抗原特异性免疫反应，从而在肿瘤免疫中发挥至关重要的作用。有研究表明肿瘤患者的DC，尤其是肿瘤组织中的DC存在着免疫功能缺陷，这与肿瘤细胞介导的免疫抑制和免疫逃逸机制密切相关。本研究拟通过培养人舌鳞癌细胞株Tca83细胞，探讨其培养上清对DC的表型及功能的影响，从而寻找肿瘤本身逃避机体免疫系统监视的可能机制，为提高机体抗肿瘤免疫能力的途径提供新的理论和实验依据。 方法：选取身体健康的志愿者15人，最小年龄23岁，最大年龄26岁，其中男8人，女7人。无菌采集取志愿者外周血50ml，置入淋巴细胞分离液中，经离心分离外周血单个核细胞，吸取中间细胞层，用D-Hank's和RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，弃上清，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×10<'7>个/ml，然后接种于6孔培养板，每孔3ml。5％CO<,2>、37℃条件下孵育2小时后，吸出培养上清，用预热的培养基清洗板1次，以去除非贴壁细胞，获得贴壁的单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell，PBMC)。将PBMC分为2组，实验组：在体外用rhGM-CSF、rhIL-4和肿瘤上清液诱导单核细胞增殖分化成DC；对照组：即常规培养组，在体外用rhGM-CSF、rhIL-4诱导单核细胞增殖分化成DC，每组设3个复孔，中间适量换液并补充细胞因子。5％CO<,2>、37℃孵育5天后，对照和实验组每孔加入TNF-a 200u/ml，7天后收集各组DC。第1、3、5、7天用倒置显微镜观察DC形态；第7天每组取DC,直接免疫荧光染色法染色，流式细胞分析各组DC表面分子CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达情况。各组收集DC，扫描和透射电子显微镜下观察DC的形态。用ELISA法检测两组DC培养第7天上清中的IL-12的含量，通过以上方法观察肿瘤细胞培养上清对树突状细胞的表型和功能的影响。 结果：倒置显微镜下，可见诱导培养24小时后贴壁单核细胞聚集成少量大小不等的细胞聚体，实验组和对照组无明显的的区别。第3天可见细胞聚集成团，实验组集落数明显少于对照组，部分细胞体积增大。第5天，悬浮细胞数量增多，细胞表面有细小突起形成，细胞体积明显变大，以对照组更明显。第7天悬浮细胞有明显树突状突起，以对照组更明显，对照组细胞体积较大。培养第7天扫描电镜观察，实验组DC表面突起较少且短，而且数量明显少；对照组DC表面粗糙，胞体向周围伸出大量树枝状或裙褶状不规则突起。实验组第7天透射电镜观察，DC细胞表面伸出少量的突起，线粒体致密化，粗面内质网扩张成池状，溶酶体较少，有较多的空泡；而对照组有较多的树枝样突起，空泡较少。培养7天后，实验组CD80、CD83、HLA-DR的表达率较对照组低，差异有统计学意义(均P<0.001)，但CD86、CD1a、表达率两组差异无统计学意义(均P>0.05)。实验组DC分泌IL-12的量明显低于对照组(23.6±5.2 pg/ml对37.2±5.8pg/ml，p<0.05)。 结论：1、舌癌Tca-83细胞培养上清能够抑制树突状细胞分化和成熟，表现为DC的树突状突起明显减少。2、肿瘤细胞分泌细胞因子抑制DC的成熟，并使其表面分子CD80、CD83、HIA-DR低表达。3、加入肿瘤上清后，DC的功能受到抑制，表现为分泌IL-12的量明显减少。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述：树突状细胞与肿瘤免疫逃逸

致谢

个人简历