NF-κB抑制剂PDTC对急性肺损伤大鼠肺组织E-选择素表达的影响

摘要

目的：急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是由严重感染、创伤、休克等多种病因所致的肺组织损伤，临床表现为严重的呼吸困难。ALI中肺血管内皮细胞(endothelial cell，EC)是受损的主要靶细胞，它的活化可以作为ALI的重要标志。EC的活化使白细胞黏附、迁移增加是导致ALI发病的重要步骤，而这一过程与黏附分子的表达密切相关。E-选择素是唯一仅限于活化的EC表面表达的一种黏附分子，是EC活化的一个很好的标志。E-选择素的表达能否标志ALI的发生，能否作为早期反映ALI严重程度的指标，寻找拮抗E-选择素功能的物质能否有助于减轻ALI的发生发展，目前这方面的研究还比较少。本实验旨在用腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的方法复制大鼠ALI模型，观察ALI时E-选择素表达的变化、核转录因子NF-кB(nuclear factor-kappa B，NF-кB)对E-选择素的调节机制及NF-кB的抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(ammoniam pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)的治疗作用，探讨E-选择素在ALI发病中的机制及在诊断中的价值，并为治疗ALI开辟新途径提供理论依据。 方法：选用购自河北医科大学实验动物中心的健康雌性wistar大鼠96只，体重230～250克，采用腹腔注射LPS的方法复制大鼠急性肺损伤模型。96只大鼠随机分为4组，正常对照组(N组)以生理盐水代替LPS腹腔注射；PDTC对照组(P组)先腹腔注射PDTC(120mg/kg)，30分钟后再注射生理盐水；急性肺损伤组(L组)腹腔注射LPS(3mg/kg)；PDTC干预组(P+L组)先腹腔注射PDTC(120mg/kg)，30分钟后再注射LPS(3mg/kg)。制模后以2h、4h、8h、12h作为观测时间点处死大鼠取肺组织待用。用苏木素-伊红染色(HE染色)法做病理切片，光镜下观察肺组织形态变化以证实ALI模型制备成功，取肺组织测湿/干重比值，用免疫组化的方法分别检测肺组织E.选择素和NF-кBp65的蛋白表达，再用RT-PCR的方法检测肺组织E-选择素的基因表达。所得数据采用t检验、方差分析和直线相关分析进行统计学处理。 结果：1肺组织病理改变：N组、P组，肺组织结构完整，无炎性细胞渗出；L组，肺泡间隔增厚，肺泡壁断裂，大量炎性细胞渗出，并随着时间的延长肺组织损伤程度逐渐加重；P+L组，有同L组类似的炎性渗出改变，但相应各时间点肺组织损伤程度均较L组明显减轻。 2 肺组织湿/干重(W/D)比值：N组各时间点肺组织W/D比值(2h：4.27±0.029、4h：4.29±0.050、8h：4.28±0.038、12h：4.26±0.047)， P组各时间点W/D比值(2h：4.26±0.046、4h：4.28±0.014、8h：4.27±0.052、12h：4.28±0.028)，N组与P组相比无显著差异(P>0.05)；L组各时间点W/D比值(2h：4.70±0.081 、4h：4.94±0.082 、8h：5.50±0.074 、12h：5.80±0.071)，并随注射LPS时间的延长肺组织W/D比值不断升高，不同时间点的L组有显著差异(P<0.01)，均较对照组N组相应各时间点的数值高；在P+L组，各时间点W/D比值(2h：4.43±0.058、4h：4.52±0.057、8h：4.96±0.058、12h：5.31±0.058)与L组相对应各时间点的数值相比，均明显降低，但与对照组N组相比仍较高，相同时间点三组相比均有显著差异(P<0.01)。 3 肺组织E-选择素的蛋白表达：N组和P组各时间点各张切片在光镜下均未见E-选择素阳性表达的细胞；L组各时间点各张切片均有阳性表达的细胞，其血管内皮着色率(％)(2h：18.22±2.68、4h：31.90±4.70、8h：24.34±4.77、12h：19.28±3.27)，其中4h组着色率最高，为E-选择素蛋白表达的高峰，之后随时间的延长着色率逐渐降低，不同时间点的L组均有显著差异(P<0.01)；在P+L组，各时间点各张切片均有阳性表达的细胞，其血管内皮着色率(％)(2h：13.78±3.96、4h：22.45±4.03、8h：16.36±2.79、12h：14.63±2.58)与L组相对应各时间点相比明显降低，相同时间点两组相比均有差异(P<0.05)，其中4h组和8h组有显著差异(P<0.01)。 4 肺组织E-选择素mRNA的表达：N组和P组各时间点均无E-选择素mRNA表达；L组各时间点E-选择素mRNA表达(2h：0.3885±0.028、4h：0.8202±0.026、8h：0.6914±0.013、12h：0.5543±0.011)，其中4h组数值最高，为E-选择素mRNA表达的高峰，之后随时间的延长表达逐渐下降，不同时间点的L组有显著差异(P<0.01)；在P+L组，各时间点E-选择素mRNA表达(2h：0.2976±0.037、4h：0.5969±0.017、8h：0.5105±0.022、12h：0.4582±0.021)与L组相对应各时间点的数值相比明显降低，相同时间点两组相比均有显著差异(P<0.01)。 5 肺组织NF-кBp65的蛋白表达：N组各时间点各张切片5个视野范围内NF-кBp65阳性细胞总数(2h：162.33±6.95、4h：167.33±5.96、8h：164.17±8.61、12h：167.33±8.80)，P组相应各时间点阳性细胞总数(2h：166.67±5.65、4h：162.83±5.85、8h：161.33±8.33、12h：165.17±7.25)，N组和P组相比无显著差异(P>0.05)； L组各时间点5个视野范围阳性细胞总数(2h：609.67±23.87、4h：375.33±12.61、8h：231.83±15.74、12h：210.50±10.55)，其中2h组阳性细胞数最多，为NF-кBp65表达的高峰，且光镜下代表阳性表达的棕黄色颗粒多出现在细胞核内，之后随时间的延长阳性细胞数逐渐减少，不同时间点的L组有显著差异(P<0.01)，均较对照组N组相应各时间点的数值高；在P+L组，各时间点5个视野范围阳性细胞总数(2h：365.50±10.17、4h：266.83±11.99、8h：195.33±15.42、12h：185.17±13.76)与L组相对应各时间点的数值相比，均明显降低，但仍比对照组N组高，相同时间点三组相比均有显著差异(P<0.01)。 6 相关分析：肺组织中NF-кBp65与E-选择素蛋白含量之间具有直线相关性，两者呈显著正相关(r=0.7851， P<0.01)，NF-кBp65与E-选择素mRNA之间也具有直线相关关系，两者呈显著正相关(r=0.8116， P<0.01)。 结论：1注射脂多糖2h后，在大鼠肺组织观察到了ALI的病理改变，模型复制成功。ALI时，大鼠肺组织出现标志着EC活化的E-选择素基因和蛋白的表达，并随时间的延长逐渐上升，4h时达到高峰，提示EC的活化发生在ALI早期阶段，其高表达E-选择素可能启动EC与白细胞黏附是造成ALI发病机制之一。 2 E-选择素仅表达在活化的EC表面，在ALI的早期发挥黏附作用，这一特异性使其有可能成为ALI早期的诊断指标；且E-选择素表达越高病情越严重预后越差，故其可能成为监测感染所致的ALI病情严重程度和预后的指标。 3 ALI时大鼠肺组织中核转录因子NF-кB被激活，其功能亚基NF-кBp65表达上调，它的表达增加与肺组织E-选择素的高表达具有正相关关系；且应用NF-кB的抑制剂PDTC可以抑制NF-кB活化，阻碍NF-кBp65亚基向细胞核转移，同时观察到E-选择素基因和蛋白表达的降低，提示E-选择素的基因表达与NF-кB的调节密切相关。 4 给予PDTC干预后，从病理切片上可以看到大鼠肺组织水肿、炎性渗出明显改善，NF-кBp65核移位减少，E-选择素基因和蛋白的表达明显下降，从另一个角度证实了EC活化后高表达E-选择素在ALI中发挥重要作用；应用PDTC后可能阻止了EC与白细胞的启动黏附，从而可以减轻肺组织的受损程度，这一研究结果为ALI的治疗提供了新的途径。

目录

摘要

前言

材料和方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述E-选择素在急性肺损伤中的作用

致谢

个人简历