石家庄地区猪链球菌的分离鉴定及其快速检测方法的建立和应用

摘要

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是一种重要的人兽共患病原菌，急性病例常表现为出血性败血症、脑膜炎、突然死亡，慢性病例以关节炎、心内膜炎为特点，主要引起人急性脑膜炎、感染性休克综合征甚至死亡。本文从病原、流行病学、临床症状及病理变化、毒性因子、检测方法、药敏试验以及防治等方面分别做了详细的综述，并通过病原分离鉴定、猪链球菌2型毒力因子的PCR检测、猪链球菌1、2、7和9型的双重PCR检测方法的建立及应用等三个试验对石家庄地区猪链球菌病的发病、快速检测方法的建立和应用及其防治情况进行了针对性地阐述。 本试验分别从石家庄市地区各县市猪场送检的疑似病例中分离得到72株猪源链球菌，选择其中具有一定区域、特定致病类型的代表性菌株18株，进行了病原分离和分群鉴定，并与标准株进行了对比试验。初步证实本地区流行菌株仍以兰氏分群C群及D群居多，以C群链球菌为主占50％(9/18)，但D群有上升趋势占33.3％(6/18)，此外还出现1株G群占5.6％(1/18)，还存在两株未定群的猪链球菌。其分布无明显的地域性。 石家庄地区SS的毒力因子分布情况不很清楚，本实验对石家庄地区SS分离株的毒力因子进行检测。选取猪链球菌8种主要毒力因子，设计与合成8对引物，用PCR方法进行检测。结果显示:已知21株SS2菌株中90.5％(19/21)表现为cps2/gdh+/gapdh+/ef+/mrp+/sly+/fbps+/orf2+；对石家庄周边区县送检的疑似SS的病例中，仅有10％左右表现为cps2/gdh+/gapdh+/ef+/mrp+/sly+/fbps+/oft2+，比较可见石家庄地区的猪链球菌与国内其他地区SS分离株的基因型不同，提示石家庄目前SS的主要流行菌株是具有部分毒力因子的弱毒菌株。 以猪链球菌特异性的谷氨酸脱氢酶基因(gdh)及猪链球菌型特异性的荚膜多糖合成相关的基因(cps1J，cps2J，cps7H，cps9G)为目的基因，设计合成五对引物，分别进行PCR扩增，建立了猪链球菌1、2、7和9型的双重PCR方法，并用猪链球菌所有35个血清型的参考菌株，B群、C群、D群各1株链球菌及4株非链球菌菌株验证了1、2、7和9型双重PCR方法的特异性；对双重PCR进行了敏感性试验。 结果:1、2、7和9型的双重PCR都在100cfu时仍能扩增出目的基因片段；试验结果显示所建立的检测方法具有良好的特异性和敏感性。选取21株已知的2型菌株用2型的双重PCR方法进行了检测，其检测符合率为100％。在石家庄市周边区县随机采取了360份健康猪的扁桃体和136份病猪组织，用所建立的猪链球菌1、2、7和9型的双重PCR方法对其进行了猪链球菌的检测。从360份健康猪扁桃体中检测鉴定出猪链球菌54株，其检出率达到15.0％。54株猪链球菌中，2型菌有8株，7型菌有3株，9型菌有3株，未能检测到1型猪链球菌，40株菌未能进行定型。而从136份病猪组织中检测鉴定出了24株猪链球菌，分别来自6个区县，结果发现其中的2型猪链球菌2株，而7，9型猪链球菌各1株，其余均不是1、2、7和9型猪链球菌。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词索引表

声明

1引言

1.1猪链球菌病原学

1.2猪链球菌病流行病学

1.3临床症状

1.4病理变化

1.5猪链球菌的毒力因子

1.6猪链球菌检测方法

1.7药敏试验

1.8人链球菌病

1.9疾病防治

1.10本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1生物学及主要化学试剂

2.1.2仪器设备

2.1.3菌株

2.1.4部分试剂的配制

2.1.5实验动物

2.2试验方法与程序

2.2.1猪链球菌分离鉴定与生物学特性研究

2.2.2猪链球菌分离株毒力因子的PCR检测

2.2.3猪链球菌1、2、7、9型双重PCR检测方法的建立

3结果

3.1猪链球菌分离鉴定与生物学特性研究

3.1.1病原分离与培养特性

3.1.2生化鉴定试验结果

3.1.3血清群鉴定结果

3.1.4溶血试验结果

3.1.5药敏试验结果

3.1.6动物致病性试验结果

3.1.7小鼠最小致死量(MLD)测定结果

3.2猪链球菌分离株毒力因子检测结果

3.3猪链球菌1、2、7和9型双重PCR方法的建立

3.3.1单重PCR扩增结果

3.3.2猪链球菌1，2，7，9型双重PCR方法的建立

4讨论

4.1关于猪链球菌的分群鉴定

4.2关于猪链球菌毒力因子的PCR检测

4.3关于猪链球菌1、2、7、9型双重PCR检测方法的建立

4.3.1猪链球菌PCR检测方法

4.3.2双重PCR方法优化

4.3.3猪链球菌多重PCR方法的研究

4.3.4猪链球菌双重PCR方法于其他方法的比较

5结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢