牡蛎活性肽的提取及活性初步研究

摘要

第一部分牡蛎活性肽的初步分离纯化 目的:探讨牡蛎活性肽的分离纯化方法。 方法：首先运用滤纸过滤法、低温高速离心法、微孔滤膜滤过法、壳聚糖絮凝法等4种手段对牡蛎酶解液进行层析前预处理；然后分别过Sephadex G-10、G-15、G-25、G-50和G-75层析柱；并采用常规Tris-甘氨酸系统SDS-PAGE与小肽Tricine-SDS-PAGE相结对其中Sephadex G-25的各个洗脱峰肽段分子量分布情况进行粗略分析。 结果： 1、在四种层析前预处理方法中，滤纸过滤法的处理过程比较困难，而且在4℃储存中有混浊生成。而低温高速离心法、微孔滤膜滤过法和壳聚糖絮凝法的处理效果都比较好，除微孔滤膜滤过法处理过程比较困难外，其余两者处理过程都是容易的。 2、SephadexG-15对牡蛎酶解液的分离效果比Sephadex G-10，G-25，G-50和G-75好，其层析图谱出现8个洗脱峰，而且峰形都比较对称，区带也较窄。 3、由电泳结果可知，G-25 Ⅰ峰：主要为约66.2 kDa的大蛋白；G-25 Ⅱ峰：在8159D-66.2kDa之间均有不同分子量的肽段区带分布；G-25Ⅲ峰：该洗脱峰收集液冻干品，不溶于洗脱液，也不溶于电泳样品处理液，对其电泳结果不能判断；G-25Ⅳ峰：主要为小于2512D的小肽等物质。 结论：低温高速离心法作为牡蛎酶解液层析前预处理的方法，该法简便快捷，适合用于实验研究。Sephadex G-15层析柱对牡蛎酶解液的分离效果是最好的。牡蛎活性肽的分子量分布广泛，组成复杂。 第二部分牡蛎活性肽对人舌鳞癌Tca8113细胞抑制作用的初步研究 目的：研究牡蛎活性肽BPO G50-Ⅱ对人舌鳞癌Tca8113细胞抑制作用。 方法：采用台盼蓝拒染法以生理盐水(N．S)为阴性对照，平阳霉素为阳性对照药，观察BPO G50-Ⅱ不同浓度、不同作用时间对人舌鳞癌细胞株(Tca8113)体外增值的抑制作用；应用倒置相差显微镜、H．E．染色和透射电镜观察细胞形态学的改变；AO-EB荧光法观察细胞凋亡。 结果：Fca8113细胞经过BPO G50-Ⅱ处理24、48、72h后，半数抑制浓度(IC50)分别为1.50 mg/ml、O．57 mg/ml、0.20mg/ml，Tca8113细胞生长明显受到抑制，BPOG50-Ⅱ浓度效应关系显著，且细胞生长抑制效应随BPO G50-Ⅱ作用时间的延长而增强。普通光学显微镜和透射电镜下观察到牡蛎活性肽BPO G50-Ⅱ作用后的Tca8113细胞形态学改变：细胞微绒毛减少，细胞体积缩小，可见部分细胞核仁消失。细胞核染色质固缩成块状沿核膜内侧排列，呈境界分明的块状，部分细胞核解体；胞浆浓缩，内质网、高尔基复合体膨大形成泡状，胞浆内出现透明小泡等。AO-EB荧光法观察到药物处理组有大量的胞核呈致密浓染或有片段状的、着不均匀绿色荧光的早期凋亡细胞以及核染色质着橙色并致密浓缩或呈碎片的晚期凋亡细胞出现。 结论：牡蛎活性肽BPO G50-Ⅱ对人舌鳞癌细胞株(Tca8113)体外增殖的具有抑制作用且引起细胞形态学改变，并能诱导其发生凋亡。 第三部分牡蛎酶解液的抗氧化活性研究 目的：探讨牡蛎酶解液的抗氧化活性。 方法：用普鲁士蓝反应法测定牡蛎酶解液还原能力，在DPPH体系、Fenton 体系和邻苯三酚自氧化体系中分别检测牡蛎酶解液清除二苯代苦味酰自由基(DPPH·)、羟基自由基(·OH)和超氧阴离子(O2-·)的能力，并考察牡蛎酶解液在Fe2+诱发卵黄脂蛋白过不饱和脂肪酸(PUJFA)过氧化体系中的抗氧化作用。 结果：牡蛎酶解液清除DPPH·和·OH的EC50分别为7.3l3和1.330mg/ml；牡蛎酶解液(17.800mg/ml)对超氧自由基和卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率分别为18.86％和82.97％。 结论：牡蛎酶解液具有显著的清除DPPH·和·OH作用，且活性与剂量呈正相关，并对卵黄脂蛋白脂质过氧化也显示出了较强的抑制作用。

目录

论文说明：主要缩略词

声明

前言

第一部分牡蛎活性肽的初步分离纯化

材料和仪器

实验步骤与方法

结果

讨论

第二部分牡蛎活性肽对人舌鳞癌Tca8113细胞抑制作用的初步研究

材料和仪器

实验步骤与方法

结果

讨论

第三部分牡蛎酶解液的抗氧化活性研究

材料和仪器

实验步骤与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述：牡蛎活性肽的研究进展

致谢