水牛供体细胞组蛋白乙酰化与核移植胚胎发育能力相关性的研究

摘要

本研究主要探讨供体细胞的组蛋白乙酰化水平对水牛核移植效果的影响，并对核移植胚胎、体外受精(IVF)胚胎、孤雌激活(PA)胚胎的组蛋白乙酰化水平进行初步分析，探讨组蛋白乙酰化水平与胚胎发育能力的相关性。 以水牛成纤维细胞为材料，建立了使用实时荧光定量PCR技术检测mRNA表达的方法。以牛mRNA序列作为参考序列设计的引物可成功克隆水牛组蛋白乙酰化转移酶1(HAT1)，去乙酰化酶1(HDAC1)和组蛋白H2A基因片段，测序结果表明所得cDNA序列与牛同源性在98％以上；三对引物的反应性完全满足实时荧光定量PCR的要求；两个目的基因HAT1、HDAC1扩增效率(98.2％，97.5％)与参照基因H2A(106％)接近；当反应体系中，cDNA模板量为0.5μL(相当于总RNA 50ng)，浓度为lμM的引物0.5μL时，能高效获得特异性强的目的产物。 用实时荧光定量PCR技术对用去乙酰化酶抑制剂Tichostatin A(TSA)处理的供体细胞的HATl、HDACl．mRNA变化情况进行了检测。结果发现：两种基因mRNA水平随TSA的处理时间、浓度不同发生相应的变化。0.15μM TSA处理72h可显著提高HAT1的mRNA水平(P<0.05)，rSA处理48h时可显著降低HDACl的mRNA水平(P<0.05)。 探讨了TSA处理供体细胞对其核移植效果的影响。结果显示，随着TSA处理浓度升高，核移植胚胎的卵裂率、囊胚率逐渐升高；当以0.15μM TSA处理72h、0.3μM TSA处理48h、0.6μM TSA处理24h的细胞作为供体时，可以显著提高核移植胚胎的发育率(P<0.05，囊胚率分别为：30％、30.8％、30.3％vs 19％)。对不同来源胚胎组蛋白第8位赖氨酸残基乙酰化水平的差异进行了初步的分析。不同来源胚胎组蛋白乙酰化水平在不同阶段均发生动态变化：供体经TSA处理过的核移植胚胎组蛋白乙酰化水平除2-细胞期低于PA胚胎、8-细胞期低手IVF胚胎外，其余各发育阶段均高于供体未作处理的核移植胚胎、IVF胚胎和PA胚胎；供体未作处理的核移植胚胎组蛋白乙酰化水平在4-细胞期出现短暂的升高后又下降，随后变化模式与TSA处理组相似；IVF胚胎的组蛋白乙酰化水平则是持续升高，在囊胚期达到最高；PA胚胎的组蛋白乙酰化水平除4、8-细胞期较低外，其余发育阶段相对稳定。 以上结果表明：(1)参照已经公布的牛mRNA序列可以设计出用于水牛H2A，HAT1，HDAC1基因分析的实时定量PCR引物；(2)适宜的引物、高质量的cDNA以及合适的PCR体系是SYBR Green I实时荧光定量PCR成功的关键；(3)适宜浓度的TSA培养处理水牛体细胞一定时间可改变水牛体细胞组蛋白乙酰化相关基因的表达水平；(4)核移植效率可能与供体细胞的组蛋白乙酰化水平有关，适宜浓度的TSA培养处理水牛供体细胞一定时间可提高其核移植后的胚胎发育能力；(5)。胚胎发育能力与其组蛋白的乙酰化水平密切相关，IVF胚胎的组蛋白乙酰化水平高于PA胚胎。

目录

文摘

英文文摘

第一章体细胞核移植中核的重编程与组蛋白乙酰化的研究进展

一、体细胞核移植中核的重编程

(一)体细胞种类对核移植效果的影响

(二)供体细胞核的重编程不完全

二、组蛋白乙酰化的研究

(一)组蛋白研究概述

(二)组蛋白乙酰基转移酶(HATs)和去乙酰基酶(HDACs)

(三)组蛋白乙酰化的作用

三、本研究的目的和意义

第二章组蛋白乙酰化相关基因表达的检测方法建立

1.材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2.结果与分析

2.1总RNA的检测

2.2 PCR扩增目的片断

2.3序列测定以及同源性分析

2.4扩增效率的鉴定

2.5实时荧光定量PCR条件的优化

3.讨论

3.1引物对实时荧光定量PCR的影响

3.2模板、引物模板配比关系对实时荧光定量PCR的影响

3.3溶解曲线与实时荧光定量PCR的特异性

3.4基因表达的相对定量

3.5内参基因的选择对基因表达相对定量结果的影响

4.结论

第三章水牛供体细胞组蛋白乙酰化与核移植胚胎发育能力相关性的研究

1.材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

1.3试验设计

1.4数据统计分析

2.结果与分析

2.1 Real-time PCR技术检测TSA对基因HAT1 mRNA表达水平的影响

2.2 Real-time PCR技术检测TSA对基因HDAC1 mRNA表达水平的影响

2.3供体细胞组蛋白乙酰化水平与核移植胚胎发育率的关系

2.4免疫荧光染色抗体浓度的优化

2.5各类型胚胎组蛋白乙酰化水平变化规律

3.讨论

3.1 TSA处理后HAT1、HDAC1 mRNA表达水平的动态变化

3.2供体细胞组蛋白乙酰化水平对核移植胚胎发育率的影响

3.3胚胎组蛋白乙酰化水平与发育能力的相关性

4.结论

参考文献

附录

致谢

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