前房相关免疫偏离中CD94在CD8T细胞上的表达及作用

摘要

目的：可溶性蛋白抗原注入眼前房后能诱导出一种全身性的免疫耐受，称为前房相关免疫偏离(anteriorchamber-associatedimmunedeviation，ACAID)。ACAID的主要特点为抗原特异性迟发型超敏反应(delayed-typehypersensitivity,DTH)受抑制和补体结合性抗体缺失。在ACAID的形成过程中产生两类调节性T细胞(regulatoryTcells，Treg)，一类是抑制DTH反应形成的CD4+Treg，另一类是抑制DTH反应发生的CD8+Treg。ACAID中CD8+Treg的细胞表型和功能特点至今尚不清楚。CD94分子属于C型凝集素家族，它与不同的NKG2分子结合形成异源二聚体发挥功能。与相应配体Qa-1或HLA-E结合后，CD94可调控NK细胞和CD8+T细胞的毒性及存活。近来研究显示CD94-Qa-1系统参与ACAIDCD8+Treg的诱导，但CD8+CD94+T细胞的功能及特点尚不清楚。为此，我们对ACAID中CD8+T细胞的功能机制和CD94分子在ACAID鼠CD8+T细胞上的表达及CD8+CD94+T细胞的功能特点进行了研究。 方法：在C57BL/6鼠前房注入OVA，7天后OVA足底皮下免疫诱导ACAID模型。仅OVA或BSA足底皮下免疫为常规免疫组(OVAs.c.或BSAs.c.)，前房注射PBS为PBS前房对照组(PBSa.c.)，前房输入OVA但无皮下免疫为OVA前房注射组(OVAa.c.)。通过检测DTH反应以评价ACAID是否诱导成功。从ACAID鼠和正常鼠脾脏磁珠分选CD8+T细胞，进行局部过继转移实验检测CD8+T细胞对OVA或BSA诱导的DTH反应的抑制效应。RT-PCR和流式细胞术用来检测CD8+T细胞CD94和NKG2A的mRNA和蛋白表达水平。运用流式细胞术检测细胞毒性相关分子颗粒酶B和穿孔素及转录因子Foxp3在CD8+T细胞上的表达。从ACAID鼠和常规免疫鼠脾脏磁珠分选CD8+CD94+T和CD8+CD94T细胞，体外用细胞增殖实验检测这两群细胞是否具有免疫抑制功能。用酶联免疫吸附实验检测CD8+T细胞、CD8+CD94+T和CD8+CD94T分泌的抑制性细胞因子IL-10和TGF-β1，用抗体阻断实验检测TGF-β1是否在CD8+T细胞、CD8+CD94+T细胞介导的免疫抑制中发挥作用。 结果：OVA诱导的ACAID鼠CD8+T细胞可抑制OVA引发的DTH反应，但对BSA引发的DTH反应没有抑制效应。与正常小鼠和前房PBS注射鼠相比，前房注射抗原和皮下免疫均可在mRNA和蛋白水平上调CD94和NKG2A在CD8+T细胞上的表达。流式细胞分析显示各组CD8+CD94+T细胞表达低水平颗粒酶B、穿孔素和Foxp3。从ACAID鼠和常规皮下免疫鼠磁珠分选的CD8+CD94+T细胞在OVA和CD3单抗联合刺激下增殖水平低下，而CD8+CD94-T细胞则增殖强烈。ACAID鼠CD8+CD94+T细胞在体外可显著抑制已致敏小鼠脾单个核细胞增殖并呈剂量依赖性，CD8+CD94-T细胞无此功效。常规免疫鼠CD8+CD94+T和CD8+CD94-T细胞在体外均无免疫抑制功能。ELASA结果显示ACAID鼠CD8+T细胞在特异性抗原刺激下分泌TGF-β1显著高于正常小鼠CD8+T细胞：ACAID鼠CD8+CD94+T和CD8+CD94-T细胞分泌IL-10显著高于皮下免疫鼠，具有统计学差异，但IL-10在两个亚群表达水平相当；ACAID鼠CD8+CD94+T细胞分泌TGF-betal最多，显著高于ACAID鼠CD8+CD94-T细胞、皮下免疫鼠CD8+CD94+T细胞和CD8+CD94-T细胞的分泌水平，后三者之间无统计学差异。TGF-β1阻断抗体可部分抑制ACAID鼠CD8+T细胞、CD8+CD94+T细胞的免疫抑制活性。 结论：ACAID鼠CD8+T细胞在体内具有免疫抑制活性，其机制与分泌大量TGF-β1有关。ACAID鼠CD8+CD94+T细胞与经典CD8+CTL不同，它们在体外具有免疫抑制活性并可分泌大量TGF-β1，提示ACAID中CD8+Treg主要分布在CD94+T细胞亚群。然而，皮下免疫鼠CD8+CD94+T细胞体外不显示抑制活性，提示CD94并非CD8+Treg的特异性细胞表面标志。

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