前房相关免疫偏离中CD8+调节性T细胞的相关研究

摘要

多种抗原(如可溶性蛋白抗原、病毒编码的蛋白抗原及次要组织相容性抗原等)被注射入前房后，能诱导出一种全身性的免疫反应偏离，称为前房相关免疫偏离(anterior chamber associated immune deviation，ACAID)。其特点为抗原特异性的迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity,DTH)缺如、细胞毒T细胞前体细胞克隆扩增以及非补体结合性抗体水平增加。ACAID能保护眼部免受抗原特异性免疫反应的损伤。 在ACAID的形成过程中至少存在两类调节性T细胞，一类是抑制DTH反应形成的CD4+调节性T细胞，另一类是抑制DTH反应表达的CD8+调节性T细胞。近年来，随着对调节性T细胞研究的不断深入，发现Foxp3是调节性T细胞的特异性的标志分子。但研究大都集中于CD4+CD25+调节性T细胞，而且Foxp3亦主要表达于CD4+CD25+Tr。最近，研究逐渐发现在人与啮齿类动物模型体内存在CD8+Tr，并提出Foxp3在其中的表达。 此外，TGF-β1及IL-10是调节性T细胞最主要的两种效应性细胞因子。TGF-β对于调节性T细胞的诱导形成及其在外周的维持均有重要的作用。以往对于ACAID的研究也发现这两类细胞因子是ACAID形成不可缺少的。但是，对于ACAID中CD8+Tr是否通过它们发挥抑制作用尚不十分清楚。 本课题首先将OVA注射至小鼠眼前房诱导出ACAID动物模型，并用正常小鼠及前房注射PBS的小鼠作为对照，通过局部过继转移实验证实了ACAID小鼠脾脏中CD8+T细胞具有抑制功能；其次应用FCM及RT-PCR检测ACAID小鼠脾脏细胞刺激前后CD8+T细胞中Foxp3在蛋白水平和mRNA水平的表达；最后应用ELISA分析了ACAID小鼠脾脏中CD8+T细胞分泌TGF-β1及IL-10的水平，并进一步通过抗TGF-β1阻断抗体证实了这群CD8+Tr以分泌TGF-β1发挥抑制功能。为进一步阐明ACAID中CD8+Tr的作用机制奠定了基础。本课题的研究主要分为以下三部分： 第一部分 ACAID模型的建立及ACAID中CD8+T细胞抑制功能的测定。 目的:通过前房注射OVA来诱导ACAID，为实验研究提供可靠的动物模型。并证实ACAID小鼠脾脏中CD8+T细胞的抑制功能。 方法: (1) 采用乙醚吸入法麻醉C57BL/6小鼠，在手术显微镜下用玻璃微量注射针将5ul OVA(20mg/ml)溶液注入小鼠眼前房；前房注射后第14天于小鼠后足垫内皮下注射100ul OVA(2.5mg/ml)溶液与等体积完全弗氏佐剂的混悬液，总体积为0.2ml；7天后于小鼠右耳廓皮内注射20ul OVA(20mg/ml)溶液，左耳廓皮内注射相同剂量的无菌PBS溶液，24小时后检测DTH反应，以评价ACAID是否形成。 (2)采用局部过继转移实验测定CD8+T细胞的抑制功能。磁珠分选ACAID小鼠脾脏CD8+T细胞，与皮下免疫小鼠的脾脏细胞按1∶1混合重悬于10mg/mlOVA溶液中；取20ul细胞混悬液皮内注射至正常小鼠右耳廓内，左耳廓皮内注射相同剂量的OVA(10mg/ml)溶液，注射前及注射后24小时检测耳廓肿胀程度。 结果: (1) DTH检测结果显示，ACAID组小鼠的耳廓肿胀度与阴性对照组相当，较阳性对照组小鼠低，存在非常显著性统计学差异(P<0.01)，即ACAID组中DTH反应受抑制。 (2)从ACAID小鼠脾细胞中分选出的CD8+T细胞能抑制由皮下免疫小鼠脾细胞作为免疫细胞所引起的小鼠耳廓的肿胀反应。其肿胀程度与阴性对照组相当，较阳性对照组低，存在显著性统计学差异(P<0.05=。 结论:通过检测DTH反应表明，前房注射OVA抗原能成功诱导出ACAID；ACAID小鼠脾脏中CD8+T细胞具有抑制功能。这为后续的实验研究奠定了基础。 第二部分 ACAID小鼠脾脏CD8+T细胞中Foxp3的表达。 目的:检测ACAID小鼠脾脏CD8+T细胞中Foxp3在蛋白和mRNA水平的表达。 方法:使用流式细胞术(FCM)检测正常组、ACAID组及前房注射PBS对照(PBS-AC)组各组脾脏细胞未刺激及分别经多克隆刺激或抗原特异性刺激后CD8+Foxp3+T细胞的比例；使用RT-PCR分析各组小鼠脾脏cD8+细胞未刺激及分别经多克隆刺激和OVA刺激后Foxp3在mRNA水平的表达。 结果:FCM结果显示，ACAID小鼠的脾脏细胞经多克隆刺激或特异性刺激后，其中CD8+Foxp3+细胞的比例均增加；而ACAID小鼠脾脏CD8+T细胞中Foxp3 mRNA的表达仅在多克隆刺激后增加。 结论:在ACAID形成时，脾脏CD8+T细胞表达Foxp3增加，提示cD8+Foxp3+T细胞可能与这一免疫耐受的形成有关。 第三部分 ACAID小鼠脾脏CD8+T细胞中细胞因子的分泌及相关功能的研究 目的:检测ACAID小鼠脾脏CD8+T细胞分泌TGF-β1及IL-10的情况，并进一步探讨这群CD8+T细胞是否通过分泌TGF-β1或IL-10发挥抑制功能。 方法:使用ELISA检测．ACAID中CD8+T细胞分泌TGF-β1及IL-10的水平；在局部过继转移实验中使用抗TGF-β1阻断抗体测定TGF-β1在其中的作用。 结果:ACAID小鼠脾脏中CD8+T细胞能以抗原特异性的方式分泌TGF-β1；在局部过继转移实验中，抗TGF-β1阻断抗体能阻断ACAID中传出性CD8+调节性T细胞的抑制功能。 结论:ACAID中的CD8+调节性T细胞通过分泌TGF-β1发挥其抑制功能。 小结 本课题研究发现，将OVA注射至小鼠眼前房能诱导出ACAID；ACAID小鼠脾脏CD8+T细胞具有抑制功能，在局部过继转移实验中能抑制DTH反应的表达；ACAID小鼠脾脏细胞在体外经多克隆刺激后，其CD8+T细胞上Foxp3的表达在蛋白水平及mRNA水平均增加，而用OVA在体外刺激ACAID小鼠脾脏细胞，其中CD8+T细胞上Foxp3的蛋白水平表达增加；ACAID小鼠脾脏CD8+T细胞能分泌大量的TGF-β1，抗TGF-β1阻断抗体能阻断ACAID中CD8+T细胞的抑制功能。这些结果提示CD8+Foxp3+T细胞可能是ACAID形成过程中一群重要的调节性T细胞，TGF-β1是与ACAID CD8+T细胞抑制功能相关的细胞因子之一。为进一步阐明AcAID中CD8+调节性T细胞的作用机制奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分ACAID模型的建立及ACAID中CD8+T细胞抑制功能的测定

1.1材料和方法

1.2结果

1.3讨论

第二部分ACAID小鼠脾脏CD8+T细胞中Foxp3的表达

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

第三部分ACAID小鼠脾脏CD8+T细胞中细胞因子的分泌及相关功能的研究

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

总结

展望

参考文献

英文缩写词汇表

附录

致谢