南中国海红树林内生真菌抗菌活性研究

摘要

红树林是生长在热带海岸潮间带的一种特殊植被，具有独特的生理和生态特异性，使得在该环境中栖息的微生物具有丰富的生物多样性。据报道，已经从红树林植物中分离到大量的细菌、真菌、放线菌等，并从它们的次级代谢产物中发现很多结构新颖的化合物。 我国南海海岸是我国红树林的重要分布区。本论文采集了广东省珠海市淇澳岛-担杠岛红树林自然保护区和广东省惠州市惠东县白沙村、巽寮湾等地的真红树林、半红树林和伴生红树林植物的茎、叶、花、果实等样品，采用添加海水的PDA培养基对这些样品中的内生真菌进行了分离，共分离到红树林内生真菌185株，其中在148株叶中分离得到，占总分离量的79.7％；20株在茎中分离得到，占总分离量的10.8％；从其他部位共分离到内生真菌17株，占总分离量的9.19％。经形态学的方法初步种属鉴定，这些内生真菌分别属于3纲、7目、10科、39属，表明这两个海域的红树林内生真菌具有丰富的多样性。 在对分离到的海洋红树林内生真菌进行形态学鉴别的基础上，本研究还采用电喷雾离子化(ESI-MS)的方法初步探讨了代谢组学在红树林内生真菌种属鉴别中的应用。 本论文还采用滤纸片法，以大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉为指示菌株，对分离自上述两个海域的185株内生真菌进行了抗细菌、真菌活性筛选，结果得到：其中96株内生真菌的培养液或菌体提取物至少对一种指示细菌有抑制作用，占总筛选菌数的51.8％；有71株内生真菌的培养液或菌体提取物至少对一种指示真菌有抑制作用，占总筛选菌数的38.4％。鉴于传统抗菌活性筛选方法存在费时、费溶剂的弊端。本论文建立了一种简单、快捷的微量提取方法用于抗菌活性筛选。我们采用L9(34)正交试验设计，以提取物重、抗白色念珠菌、抗金黄色葡萄球菌活性为考察指标，对微量提取法中的条件进行了研究。在主要考虑抗真菌活性的前提下，选择最佳的提取条件为：提取片数为6片、(二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇=2：3：1)混合溶剂做提取溶剂、超声提取三次、每次20分钟。在最佳提取条件下，采用单因素实验设计对提取片数和相关的提取物重量进行了研究，发现在提取片数为7片，稀释体积为400μL时可制的接近1mg/mL的筛选样品。并用微量提取方法对29株内生真菌的活性做了筛选，发现其中有6株对大肠杆菌有活性；1株对金黄色葡萄球菌有活性；3株对白色念珠菌有活性。筛选的阳性率与悬浮态发酵培养得到的筛选样品的阳性率相当。 LF4-7L是来源于湛江红树林植物中的一种内生真菌，经拓扑异构酶活性筛选发现其具有抗肿瘤的活性。本研究对内生真菌LF4-7L的次级代谢产物进行了研究，从中分离到两个单体化合物，经1H-NMR、13C-NMR、质谱等波谱学方法鉴别了结构，分别为镰刀菌酸A(Fusaric acidA)和甾醇。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章序言

1.1植物内生真菌研究概况

1.1.1植物内生真菌的多样性及分布

1.1.2植物内生真菌研究的内容及意义

1.1.3国内外植物内生真菌的研究概况

1.1.4植物内生真菌的研究方法

1.1.5植物内生真菌研究的发展前景

1.2树林植物内生真菌研究

1.2.1树林概况

1.2.2树林内生真菌的分离

1.2.3红树林内生真菌次级代谢产物的研究

1.3本论文的研究内容、目的及意义

第二章红树林内生真菌的分离与鉴定

2.1引言

2.2实验材料与方法

2.2.1实验材料

2.2.2实验方法

2.3实验结果与讨论

2.3.1不同培养基对菌株分离的影响

2.3.2树林内生真菌分离的结果

2.3.3树林内生真菌的种属鉴别

2.4本章小结

第三章代谢组学在红树林植物内生真菌分类中的应用

3.1引言

3.2实验材料与实验方法

3.2.1实验材料

3.2.2实验方法

3.3实验结果与讨论

3.4本章小结

第四章红树林内生真菌抗菌活性筛选

4.1引言

4.2实验材料与方法

4.2.1实验材料

4.2.2实验方法

4.3实验结果与讨论

4.3.1红树林内生真菌的抗菌活性

4.3.2活性菌株在宿主植物不同部位的分布

4.3.3活性菌株在不同种属间的分布

4.4本章小结

第五章微量提取次级代谢产物方法在内生真菌抗菌筛选中的应用

5.1引言

5.2实验材料与方法

5.2.1实验材料

5.2.2实验方法

5.3实验结果与讨论

5.3.1微量提取法提取内生真菌次级代谢产物方法的建立

5.3.2微量提取法中提取征数的选择

5.3.3部分红树林内生真菌的抗菌活性筛选

5.4本章小结

第六章红树林植物内生真菌LF4-7L次级代谢产物研究

6.1引言

6.2试验结果与讨论

6.2.1化合物S3712

6.2.2化合物M5

6.3实验材料与方法

6.3.1实验材料

6.3.2实验方法

6.4本章小结

参考文献

附录

致谢