石斑鱼虹彩病毒（SGIV）感染的分子模式初步探究及RNA干扰载体的构建

摘要

石斑鱼虹彩病毒(Singaporegrouperiridovirus，SGIV)是一种重要的鱼类传染性病毒，并给石斑鱼的养殖造成重大经济损失。对其理化性质及基因组测序、注释表明，SGIV是一种双链DNA病毒，属于虹彩病毒科蛙虹彩病毒属。与其它脊椎动物虹彩病毒不同的是，SGIV具有基因组没有甲基化等特征，因此对于其感染模式的研究及其编码基因的功能研究对于理解虹彩病毒的病理发生有重要的理论意义。 对蛙虹彩病毒属代表种Frogvirus3(FV3)的研究表明，部分结构蛋白可能在病毒感染过程中进入细胞核发挥关键作用。生物信息学分析揭示SGIV编码162个推定的开放阅读框(ORFs)；进一步分析显示推定的结构蛋白SGIVORFO12，ORF069具有核定位信号(nuclearIotalizationsignal，NLS)。通过构建ORF012，ORF069的绿色荧光蛋白GFP融合表达载体，并在石斑鱼胚胎细胞(GrouperembDoniccells，GP)进行亚细胞定位分析。结果显示ORF069编码蛋白定位于GP细胞的细胞核，推测在病毒感染过程中，ORF069基因可能在细胞核中发挥重要作用。这是首次在虹彩病毒中确定的一个定位在细胞核的结构蛋白。继续对ORF069和其它细胞核定位的病毒结构蛋白进行深入研究，将会揭示病毒功能性结构蛋白在病毒侵染过程的重要作用。 在蛙虹彩病毒属病毒的感染模型中，病毒的感染、复制过程分为两个阶段：细胞核阶段和细胞质阶段。病毒DNA在两个阶段都有复制，其中在细胞核阶段的复制是由病毒的DNA聚合酶完成的，而DNA聚合酶是否参与细胞质阶段的DNA复制还不清楚。SGIVORF128编码一个DNA聚合酶同源框。构建ORF128的绿色荧光蛋白EGFP融合表达载体，并对其进行亚细胞定位分析。结果显示SGIVDNA聚合酶在GP细胞中呈细胞质均匀分布。同时使用oligoT反转SGIV的mRNA进行PCR，发现SGIV各时期代表性基因都具有polyA尾巴；而FV3的极早期和早期基因则不具有polyA尾巴。以上结果说明SGIV感染的分子模式与FV3等蛙虹彩病毒不同。推测SGIV细胞核阶段的DNA复制是由宿主的DNA聚合酶完成的，细胞质阶段的DNA复制由病毒的DNA聚合酶参与完成。 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指在真核生物中双链RNA(dsRNA)引起与其同源的mRNA特异性降解，因而抑制相应基因表达的现象，目前已经成为研究基因功能和防治病毒性疾病的一种重要手段。我们建立了以以上基因和SGIV主要衣壳蛋白(MajorCapsidProtein，MCP)为靶基因的RNA干扰系统。首先验证了在两种鱼类细胞系FHM和GP细胞中进行RNA干扰的可行性并建立了阳性对照：以EGFP为靶基因，设计、构建了基于pSilencer3.1H1neo的RNA干扰载体，和pEGFP-N3质粒共转染FHM、GP细胞后，用RealtimePCR和荧光显微镜观察证实EGFP为靶基因的RNA干扰载体可以有效降解靶基因mRNA从而降低靶基因表达。然后构建了以SGIVORF012，ORF069，ORF072，ORF128为靶基因的RNA干扰载体。本研究首次证明RNA干扰载体系统可以用于在GP细胞中研究SGIV病毒基因的功能，为进一步深入研究以上基因功能，和研制基丁RaNA干扰技术的抗病毒方法奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第一章前言

1.1虹彩病毒简介

1.2 RNA干扰的发现、机制及其抗病毒研究

1.3核定位信号及蛋白质结构预测

1.4本论文研究的目的、意义

1.5创新点

1.6展望

第二章SGIV ORF012、069、128生物信息学分析及亚细胞定位

2.1材料与方法

2.2结果与分析

2.3讨论

2.4小结

第三章SGIV IE、DE／E、L期基因转录物研究

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.3讨论

3.4小结

第四章针对EGFP的RNA干扰载体的设计、构建及干扰效果的评估

4.1材料与方法

4.2结果与分析

4.4小结

第五章针对SGIV ORF 012、069、072、128的RNA干扰载体的构建

5.1材料与方法材料

5.2结果与分析

5.3讨论

5.4小结

全文总结及今后工作展望

1.全文总结

2.今后工作展望

参考文献

致谢