免疫调理改善脓毒症免疫功能的临床和实验研究

摘要

SEPSIS(脓毒症)是感染引起的系统性炎症反应综合征(SIRS)，是创伤、大手术、烧伤和感染等临床疾病常见并发症。SEPSIS可导致脓毒性休克(SepticShock)和多器官功能障碍综合征(MODS)，是现代医疗条件下主要死亡原因之一。由于SEPSIS的高发病率、高死亡率和高治疗费用的挑战，深入研究重症监护治疗条件下SEPSIS的治疗手段，具有重要的意义。SEPSIS是一种无法控制的炎症反应。机体炎症反应和免疫功能紊乱被视为SEPSIS和MODS发生和发展的中心环节。有效的免疫调理治疗是最终取得对该综合征治疗突破的根本途径。既往的临床抗炎治疗研究，由于未取得预期结果而宣布失败。对部分免疫抑制的SEPSIS病人进行了临床观察和研究，确认了CD14+HLA-DR作为判断SEPSIS免疫功能的指标和指导病人治疗、判断预后的可靠价值。基础研究证明：SEPSIS确实存在免疫抑制，主要被归咎于淋巴细胞凋亡所致。对SEPSIS病人同时实施免疫刺激治疗和抗炎治疗是合理和合乎逻辑的。本研究采用胸腺肽α1作为免疫刺激剂，它是体内正常的物质，没有直接促进炎症的作用，直接刺激T淋巴细胞分化、增殖、成熟，抑制T淋巴细胞凋亡。抗炎药物将采用尿蛋白酶抑制剂-乌司他丁，它是人体内一种天然的酶抑制剂，具有抑制多种蛋白酶的作用。免疫调理临床研究的进展有赖于实验研究的深入探讨，临床研究普遍存如医源性干扰因素、病人经济情况和没有病理活检等不足，本研究为了克服临床研究的不足，建立动物模型进行干预研究，旨在进一步了解和阐述脓毒症免疫调理的可能机制。故寻找和选择适宜的监控及治疗靶点，对脓毒症免疫系统进行调理，已成为现代脓毒症研究的热点和难点问题。 围绕这一问题，本课题纳入以下研究内容： 1.观察脓毒症病人免疫调理的临床研究，包括脓毒症病人的一般临床资料和病原菌分析；脓毒症病人免疫调理促炎/抗炎因子的分析：脓毒症病人免疫调理体液免疫的分析；脓毒症病人免疫调理细胞免疫和预后分析。旨在揭示脓毒症病人进行免疫调理治疗如何影响机体的促炎和抗炎细胞因子、体液免疫和细胞免疫，能否改善脓毒症病人的预后。 2.观察脓毒症大鼠免疫调理的实验研究，包括脓毒症大鼠模型的成功建立；脓毒症大鼠免疫调理淋巴器官胸腺和脾脏的分析；脓毒症大鼠免疫调理促炎和抗炎因子的分析；脓毒症大鼠免疫调理细胞免疫的分析；脓毒症大鼠免疫调理细胞凋亡和存活率的分析。旨在进一步揭示脓毒症大鼠免疫调理对淋巴器官、促炎和抗炎因子、细胞免疫和细胞凋亡以及对预后的影响。 材料和方法： 临床研究 中山大学附属第一医院外科ICU住院病人70例，根据脓毒症入选标准分为两组，凡符合入选标准的病人随机分别进入对照组和治疗组：A：对照组：经典ICU治疗。B：治疗组：经典ICU治疗同时接受蛋白酶抑制剂和胸腺肽α1治疗。本研究是前瞻、随机、单盲和对照的临床研究。观察指标：两组脓毒症病人的一般临床资料和病原学资料；促炎因子TNF-α，IL-8和抗炎因子IL-10；IgG、IgM、IgA和补体C3、CaCD4+、CD8+T淋巴细胞和CD4/CD8比值、淋巴细胞计数和CD14+单核细胞HLA-DR水平的动态变化。以入组后28天为观察时间，判断病人预后转归并随访情况。 实验研究 成功制作大鼠盲肠结扎穿孔(CecalLigation-Perforation，CLP)模型，大鼠分组：SD大鼠共分为四组，假手术组(n=20)、CLP组(n=20)、对照组(n=20)和实验组(n=20)。制作脓毒症模型后分别在3小时、12小时、48小时和72小时采血待测。观察指标：按时间点各组大鼠采血后，取胸腺和脾脏称重。福尔马林固定标本后，作H＆E染色并观察：促炎因子TNF-α，IL-8和抗炎因子IL-10；淋巴细胞计数和CD4+、CD8+T淋巴细胞和CO4/CD8比值；胸腺和脾脏淋巴细胞凋亡情况。以72小时为观察时间，判断脓毒症大鼠免疫调理的存活率。 结果： 第一部分脓毒症病人免疫调理的临床研究 第1节.脓毒症病人的一般临床资料比较，对照组和治疗组病人在年龄、性别和实验前APACHEII评分没有差异(P>0.05)。两组脓毒症病人病原学以细菌为主，两组病人的微生物感染没有统计学意义差异(P>0.05)。显示两组脓毒症病人的一般临床资料和病原学具有可比性。 第2节.脓毒症病人免疫调理促炎/抗炎因子的分析，治疗组降低TNF-α比对照组明显，两组比较均有统计学差异(P<0.05)。治疗组IL-8与对照组相比较，两组无统计学意义差异(P>0.05)。治疗组升高IL-10比对照组明显，两组比较均有统计学差异(P<0.05)。脓毒症病人免疫调理治疗可以明显降低TNF-α水平，而促炎因子IL-8水平与脓毒症经典ICU治疗相当。脓毒症病人免疫调理抗炎因子IL-10的水平比经典ICU治疗有所提高。 第3节.脓毒症病人免疫调理体液免疫的分析，治疗组的IgG水平比对照组有所提高，两组差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组的IgA、IgM、补体C3和补体C4水平与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。脓毒症病人免疫调理可以轻度提高体液免疫的IgG水平，有待日后观察，而其他体液免疫指标包括IgA，IeX，补体C3和补体C4，则与脓毒症经典ICU治疗组相当。 第4节.脓毒症病人免疫调理细胞免疫和预后分析，治疗组CD4+T淋巴细胞比对照组明显升高，两组差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组的淋巴细胞计数及CD14+单核细胞HLA-DR水平较对照组显著性升高，两组差异有统计学意义(P<0.05)。两组共死亡病人33例，均死于多器官功能衰竭，对照组20例，治疗组13例，两组有统计学差异(P<0.05)。治疗组远期生存时间较对照组明显延长，两组有统计学差异(P<0.05)。脓毒症病人免疫调理治疗可以明显提高淋巴细胞计数、CD4+T淋巴细胞和CD14+单核细胞HLA-DR表达水平，改善免疫麻痹和脓毒症病人的远期预后。 第二部分脓毒症大鼠免疫调理的实验研究 第1节.脓毒症大鼠模型(CLP模型)的建立，可见CLP大鼠弥漫的腹腔感染和肠道水肿。CLP大鼠盲肠肌层明显变薄，肠道粘膜部分或全部脱落，肠绒毛明显变短，肠腔内可见血性渗出物。盲肠结扎穿孔(CLP)脓毒症大鼠造模成功。 第2节.脓毒症大鼠免疫调理胸腺和脾脏的分析，观察到48小时，实验组胸腺重量比对照组明显增加，两组差异有统计学意义(P<0.05)。显微镜下，实验组仍能保持胸腺小叶结构，而对照组胸腺小叶结构则消失，皮质和髓质淋巴细胞明显减少。实验组和对照组脾脏重量无统计学差异(P>0.05)。实验组红髓和白髓结构尚能保持，可见脾小结存在。而对照组脾脏红髓和白髓结构紊乱，脾小结明显缩小或消失。免疫调理治疗能够明显增加脓毒症大鼠胸腺的重量，能够改善脓毒症大鼠胸腺和脾脏的组织结构。 第3节.脓毒症大鼠免疫调理促炎和抗炎因子的分析，实验组降低TNF-α和IL-8比对照组明显，两组均有统计学差异(P<0.05)。实验组提高IL-10比对照组为明显，两组有统计学差异(P<0.05)。脓毒症大鼠免疫调理治疗可以降低促炎因子TNF-α和IL-8的水平，抗炎因子IL-10的水平得到明显提高。 第4节.脓毒症大鼠免疫调理细胞免疫的分析，实验组的淋巴细胞比对照组明显升高，两组差异有显著性(P<0.05)。实验组CD4+T淋巴细胞水平比对照组明显升高，两组差异有统计学意义(P<0.05)。实验组CD4/CD8比对照组明显升高，两组差异均有显著性(P<0.05)。显示免疫调理可以提高脓毒症大鼠淋巴细胞水平、CD4+T淋巴细胞和CD4/CD8的比值。 第5节.脓毒症大鼠免疫调理淋巴细胞凋亡和存活率的分析，对照组胸腺和脾脏的淋巴细胞凋亡指数比实验组明显增高，两组有统计学差异(P<0.05)。实验组72小时存活率比对照组明显延长，两组有统计学差异(P<0.05)。显示免疫调理可以明显减轻脓毒症大鼠胸腺和脾脏淋巴细胞的凋亡程度，提高脓毒症大鼠的72小时存活率。 结论： 本研究结果表明： 1.脓毒症病人免疫调理可以明显降低促炎因子TNF-α，抗炎因子IL-10有所提高。 2.脓毒症病人免疫调理可以轻度提高体液免疫的IgG水平，有待日后观察。 3.脓毒症病人免疫调理可以提高淋巴细胞计数、CD4+T淋巴细胞和CD14+单核细胞HLA-DR水平，改善免疫麻痹和脓毒症病人的远期预后。 4.脓毒症大鼠免疫调理可以增加胸腺的重量，改善胸腺和脾脏的组织结构。 5.脓毒症大鼠免疫调理可以降低促炎因子TNF-α和IL-8，提高抗炎因子IL-10。 6.脓毒症大鼠免疫调理可以提高淋巴细胞计数、CD4+T淋巴细胞和CD4/CD8比例。 7.脓毒症大鼠免疫调理可以减轻胸腺和脾脏淋巴细胞的凋亡程度，提高脓毒症大鼠的存活率。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一部分脓毒症病人免疫调理治疗的临床研究

第一节脓毒症病人的一般临床资料和病原学分析

资料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二节脓毒症病人免疫调理的促炎/抗炎因子分析

资料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三节脓毒症病人免疫调理体液免疫的分析

资料和方法

结 果

讨论

小 结

第四节脓毒症病人免疫调理细胞免疫和预后分析

资料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分脓毒症大鼠免疫调理的实验研究

前言

第一节脓毒症大鼠动物模型的建立

材料与方法

结果

讨论

小结

第二节脓毒症大鼠免疫调理胸腺和脾脏的分析

材料与方法

结果

讨论

小结

第三节脓毒症大鼠免疫调理促炎和抗炎因子的分析

材料和方法

结果

讨论

小结

第四节脓毒症大鼠免疫调理细胞免疫的分析

材料与方法

结果

讨论

小结

第五节脓毒症大鼠免疫调理细胞凋亡和存活率的分析

材料与方法

结果

讨论

小结

全文总结

创新与展望

参考文献

附表及SSC脓毒症冶疗指南（简化）

综述 急性肺损伤应用乌司他丁治疗从基础到临床研究进展

附录

致谢