深低温冷冻大鼠肢体缺血再灌注损伤及依达拉奉干预的实验研究

摘要

我们在对缺血再灌注损伤机制研究的基础上，结合大鼠后肢血管的解剖特点，建立了经深低温冻存大鼠断肢再植(自体)骨骼肌缺血再灌注损伤模型，可最大限度地减少免疫反应等其他因素的干扰，通过检测有关生化指标以及形态学观察，能更好地研究冻存肢体再植后缺血再灌注损伤的机制及其防治措施，为临床用药提供理论依据。本课题研究内容分四个部分： 第一部分：大鼠肢体深低温冷冻后组织学的病理变化研究目的：通过本实验为肢体长期深低温保存，进而为深低温冷冻肢体再植成功的可行性研究提供形态学依据。 方法：取健康成年雄性Wistar大鼠8只，体重500～600g,将左后肢设为正常对照组，右后肢设为冷冻组。用3％戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(30mg/kg.b.w)。将双后肢均于膝关节上离断，迅速行右后断肢深低温冷冻前处理，程序降温，再移入液氮保存；实验时取出断肢并置于恒温水浴箱快速复温(6 min)，然后分别切取大腿内侧皮肤、股血管、股神经、腓肠肌等组织块，制作组织切片，并与左侧后肢各相应组织切片作形态学对比分析。 结果 (1)大体形态观察：冷冻组肢体各组织块经复温后，色泽稍淡，轻度水肿，柔软度、弹性等与正常对照组比较无明显差别。 (2)组织学观察：冷冻后各组织切片显示：①皮肤：部分表皮细胞核固缩，角化层部分脱落，真皮水肿。②血管：内膜不完整，内弹力膜部分断裂，部分管壁平滑肌细胞核固缩、扭曲，间质水肿。③神经：神经束内、神经纤维之间明显水肿。④骨骼肌：部分肌纤维细胞核固缩，间质水肿，横纹模糊。 结论 (1)经灌注冷冻保护液、梯度降温、深低温保存的皮肤、血管、神经、骨骼肌组织仍能保持一定程度的细胞结构完整性，一旦给予恢复细胞代谢活动的条件，可望能恢复其生命活动。 (2)本实验通过对冻存大鼠肢体各组织的形态学观察，可对冻存后断肢组织的活性作出初步评估，并能为断肢的再植成功提供形态学依据。 第二部分：深低温保存大鼠肢体骨骼肌再灌注损伤模型的建立及意义 目的：建立一种大鼠肢体深低温保存、再灌注损伤动物模型，进行深低温保存断肢再植后骨骼肌缺血再灌注损伤的研究。 方法 (1)实验一：取健康成年雄性Wistar大鼠12只，体重500～600g，行腹腔内注射麻醉(30mg/kg.b.w)。首先显露并切取一段长约0.5cm股动静脉，10％甲醛液固定，石蜡包埋，切片，HE染色，观测股动静脉管壁结构及其厚度。然后采用经胸主动脉乳胶灌注方法，测量大鼠股动、静脉的外径及长度，同时观察其分支、走向及分支间距离，为肢体截肢平面的选择、断肢的冷冻处理及再植的顺利完成提供理论依据。 (2)实验二：取健康成年雄性Wistar大鼠72只，体重500～600g，行腹腔内注射麻醉(30mg/kg.b.w)，随机分为A、B、C、D、E、F六组，每组12只。依照实验一所提供的有关数据，均自右腹股沟下缘沿股血管走向作切口，显露股动静脉及其分支血管，自旋髂浅支下缘平面结扎股动静脉，再迅速自此平面离断肢体；然后将断肢依不同分组情况作相应处理后再植于左后肢(将右断肢皮肤与左侧肢体皮肤缝合固定，右断肢股动脉直接与左股动脉端端吻合，股静脉与左股静脉采用套管法端端吻合)，恢复肢体血供4 h后取材进行指标检测。正常对照组(A组)：显露股动静脉只穿线而不结扎，直接取材；常温缺血再灌注组(B组)：将右断肢在室温下旷置2.5 h后行再植术，然后取材；常规深低温冻存组(C组)：右侧断肢经深低温冻存前处理，移入液氮容器内保存1个月，实验时将肢体复温、常规洗脱液灌洗后行断肢再植(取出断肢相对应大鼠)，然后取材；依达拉奉小、中、大剂量三组(依次设为D、E、F组)，均经深低温冷冻保存(同C组处理)；实验时将肢体复温，再分别应用含低、中、高剂量依达拉奉的洗脱液进行肢体灌洗，再行断肢再植术(取出断肢相对应大鼠)，然后恢复肢体血供4 h后取材。 结论 (1)制作断肢模型时，截肢平面应选择在膝最上动脉上至少约6mm处，以尽量多的保留断肢股动、静脉长度。 (2)为了使各组热缺血时间尽量保持一致，可将常温下缺血再灌注组在室温下放置约2.5 h后行再植术。 (3)鉴于股静脉解剖特点，用套管法吻合股静脉简单易行，费时短、通畅率高。 (4)因本实验模型是保持肢体再灌注4h即可取材，不必行断肢骨骼内固定及肌肉缝合，只需固定断肢皮缘(皮下组织)即可。 (5)大鼠肢体深低温冻存再植后缺血再灌注损伤动物模型制作简单，短时间内便于护理，模型稳定、安全、实用，是一种研究骨骼肌再灌注损伤的较理想的急性实验动物模型，由于本模型为自体移植，它排除了免疫排斥反应等因素，最大限度地减少了各种干扰因素的影响，能更好的研究深低温保存骨骼肌再灌注损伤的机制及其保护措施。 第三部分：深低温保存大鼠肢体骨骼肌再灌注损伤的研究 目的：利用深低温保存大鼠肢体再灌注损伤动物模型，对常温下与深低温冻存肢体再植后骨骼肌缺血再灌注损伤的病理变化进行比较、研究，初步探讨深低温冻存大鼠肢体再灌注损伤的机制，为临床防治提供理论依据。 方法：选取健康成年雄性Wistar大鼠36只，体重500～600g，随机分为三组，每组12只。分别设为正常对照组(A组)、常温缺血再灌注组(B组)、常规深低温冻存组(C组)。依据第二部分建立的深低温冻存大鼠肢体再灌注损伤动物模型，即：A组只显露右股动、静脉而不结扎、离断肢体，直接取材(取静脉血和右小腿腓肠肌组织)；B组和C组均自旋髂浅支平面迅速离断右后肢；其中，对B组断肢可将其置于室温2.5h后，再与左股动静脉吻合，恢复血供4h后取材(同A组)。对C组，经深低温冻存前处理，最后移入液氮容器中保存；实验时取出断肢，快速复温，自股动脉插管行洗脱液灌洗，然后再将断肢股动、静脉与左后肢股动、静脉吻合，恢复血供4h取材(同A组)。对以上三组，均测定每份动物血浆乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CPK)含量，测定骨骼肌组织湿干重比值(W/D)、肌细胞膜Na<'+>-K<'+>-ATP酶和Ca<'+>-ATP酶活性以及骨骼肌丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)活性，观察骨骼肌的形态学改变，以探讨常温缺血再灌注组与常规深低温冻存组骨骼肌缺血再灌注损伤程度的差异。 结论 (1)缺血再灌注损伤是一个多因素参与、多机制损伤的过程，肢体缺血再灌注损伤病理过程涉及肢体及其以外的多个脏器，可以说是整个机体的综合损伤过程。 (2)深低温在一定条件下可以保存组织细胞的活性，但同时也会对组织细胞造成不同程度的损伤，当冻存断肢再植后恢复血供(再灌注)时，肢体会发生较常温下更为严重的缺血再灌注损伤。考虑这可能是在低温损伤的基础上，叠加了缺血再灌注损伤，这种双重损伤更易导致血管内皮细胞严重受损、使缺血组织(断肢)中的微血管阻塞，血流减少或阻断，致使缺血加重，即发生更为严重的再灌注损伤。但更详细的发病机制有待进一步研究。 第四部分：依达拉奉对深低温保存大鼠肢体骨骼肌再灌注损伤干预的实验研究 目的：利用第二部分建立的深低温冻存大鼠肢体再灌注损伤动物模型，探讨冻存肢体再灌注损伤对大鼠骨骼肌细胞膜和骨骼肌线粒体的影响，评价依达拉奉对缺血再灌注损伤骨骼肌细胞膜和线粒体的保护作用及其机制。 方法：选取健康成年雄性Wistar-大鼠60只，体重500～600g，随机分为5组，依次为正常对照组(A组)、常规深低温冻存组(C)、依达拉奉小剂量组(D)、依达拉奉中剂量组(E)、依达拉奉大剂量组(F)，每组12只。建立深低温冻存大鼠肢体再灌注损伤模型。A组仅显露右股动、静脉而不结扎、离断肢体，直接取材(右侧腓肠肌组织)；C、D、E、F组均自大腿中上段(旋髂浅支下缘平面)离断右后肢，对断肢进行深低温冷冻保存处理并移入液氮容器中冻存；实验时取出冻存肢体，恒温水浴箱快速复温、灌注洗脱液；其中依达拉奉组(D、E、F组)分别采用含依达拉奉0.1mg/kg.b.w、0.3mg/kg.b.w、0.5mg/kg.b.w的洗脱液进行肢体灌注，然后行自体断肢再植(取出相对应大鼠)，恢复肢体血供4h后取材(右侧腓肠肌组织)；对以上各组，皆检测腓肠肌丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶活性(MPO)、肌细胞膜荧光偏振度(P)和膜Na<'+>-K<'+>-ATP酶、ca<'2+>-ATP酶活性变化，并且提取骨骼肌线粒体，测定线粒体丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、呼吸控制率(RCR)以及光镜观察各组骨骼肌组织的结构变化和对骨骼肌超微结构进行透射电镜检测。 结论 (1)经深低温冻存肢体再植前应用含依达拉奉洗脱液进行断肢灌注，可以明显减轻骨骼肌再灌注损伤，其机理可能是依达拉奉通过清除自由基，抑制了膜脂质过氧化反应，对肢体骨骼肌细胞膜及线粒体具有保护作用。(2)对于该药物用于防治冻存肢体缺血再灌注损伤的最佳用量有待进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分大鼠肢体深低温冷冻后组织学的病理变化研究

1.1材料和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4结论

1.5附图

1.6参考文献

第二部分深低温保存大鼠肢体骨骼肌再灌注损伤模型的建立及意义

2.1材料和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4结论

2.5附图表

2.6参考文献

第三部分深低温保存大鼠肢体骨骼肌再灌注损伤的研究

3.1材料和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4结论

3.5附图表

3.6参考文献

第四部分依达拉奉对深低温保存大鼠肢体骨骼肌再灌注损伤干预的实验研究

4.1材料和方法

4.2结果

4.3讨论

4.4结论

4.5附图表

4.6参考文献

全文小结

攻读学位期间成果

附录

致谢