脂肪源间充质干细胞复合异种骨支架构建组织工程骨

摘要

背景： 临床上器官与组织的缺损是困扰众多临床医生和患者的疾病，传统方法多采用自体或异体器官组织移植来重建与修复。由于受到供体来源限制以及免疫排斥、传播疾病等危险因素影响，人们很早就开始寻找植入性替代物来满足临床需要。组织工程学是近二十年左右迅猛发展的新学科，将对组织器官的修复与替代治疗产生划时代意义。组织工程的出现，为骨科医生和骨缺损患者带来了新的希望。组织工程技术大致由四大要素组成：种子细胞的获得；种子细胞的生长与分化；复合有细胞的载体移入体内；移植物与受区整合，组织形成。种子细胞和支架材料是骨组织工程所必需的两个最基本的要素，寻找适宜的新型支架材料已成为骨组织工程研究的热点。 目前对天然骨进行处理制成支架材料的研制尚在起步阶段，而国外已有产品问世，并在临床应用中取得很好效果。同种异体骨虽然力学性能和生物相容性好，但材料的来源少，且存在法律和伦理方面等的种种问题。异种骨来源广泛，价格低廉，经过适当处理即能使其保留骨诱导作用，并提供骨支架使其具有骨传导作用。 在骨组织工程中，成骨细胞的获取与培养是基础和重要的环节。脂肪中含有丰富的间充质细胞，其中包括脂肪源间充质干细胞。来源于人脂肪组织的脂肪源间充质干细胞具有向成脂肪、成软骨、成骨、成肌细胞和神经源细胞分化的多分化潜能，是一种理想的种子细胞。 目的： 为构建组织工程化骨，制备猪源性异种骨支架材料，并与同种异体骨支架材料对比检测猪源性异种骨支架材料的理化性能和毒性，验证脂肪源间充质干细胞作为骨组织工程的种子细胞的可行性，并初步尝试以脂肪源间充质干细胞作为种子细胞，与猪源性异种骨支架材料体外复合培养构建组织工程化骨。 材料与方法： 取低温深冻6个月的猪髂骨和新鲜健康成人尸体髂骨，制成5mm×5mm× 40mm左右的骨条，超声清洗、10％H<,2>O<,2>浸泡、75％酒精浸泡、抽真空冻干后辐照灭菌备用。扫描电镜观察支架材料的网状孔隙结构系统、三维孔状结构及材料孔径，测定材料孔隙率、蛋白质含量、钙磷含量及弹性模量。 制作异种骨支架材料和人同种异体骨支架材料的浸提液培养脂肪源间充质干细胞，倒置显微镜观察细胞，评价细胞一般形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜的变化，流式细胞仪PI法检测细胞生命周期。皮下植入2种材料，在植入4W、8W、12W、16W取材做石蜡切片HE染色观察和扫描电镜观察。采用差速贴壁培养法分离脂肪源间充质干细胞，并与普通培养法得到的脂肪源间充质干细胞进行CD44阳性鉴定和用流式细胞仪检测细胞的CD44阳性率。在第2代脂肪源间充质干细胞中加入条件培养基进行诱导，根据条件培养基的不同分成3组：①成骨诱导组：加入成骨培养基；②成脂诱导组：加入成脂培养基；③对照组：仅加入基础培养基。成骨诱导组和对照组进行碱性磷酸酶检测，成脂诱导组和对照组进行油红O染色检测。 将第2代脂肪源间充质干细胞与异种骨支架材料和人同种异体骨支架材料进行复合培养，在第7d取材料做处理后扫描电镜观察。连续7天用MTT法测定复合培养后细胞活性并绘制细胞增殖曲线。在第4d、8d、12d测定细胞碱性磷酸酶活性。 结果： 2种材料均具有骨本身的骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统，具有天然网状结构。三维支架系统形态完整。其中猪源性异种骨支架材料较人同种异体骨支架材料具有更多的三维孔隙，2种材料的孔隙大小接近，均在400μm左右。异种骨支架材料的孔隙率(57.20±1.37％)高于同种异体骨(53.21±1.63)，但蛋白含量(23.36±0.48％)低于同种异体骨(26.50±0.23)，钙(1.7×10<'5>μg/g)磷(1.0×10<'5>μg/g)含量与同种异体骨钙(1.8×10<'25>μg/g)磷(1.0×10<'5>μg/g)含量无显著性差异，异种骨支架材料和同种异体骨支架材料的弹性模量分别为 1089.89±915.65MPa和550.34±435.80MPa，无显著差异。猪源性异种骨支架材料浸提液组细胞呈梭型，有粗大的突起，并以突起互相连接，细胞核大，圆形，核浆比例大。猪源性异种骨支架材料浸提液组、同种异体骨支架材料浸提液组以及空白对照组的细胞均生长状态良好，增殖旺盛，形态没有明显差别。流式细胞仪PI法检测细胞生命周期见3组细胞G<,1>期、G<,2>期细胞百分率接近。皮下植入实验动物状态良好。 术后4W，2种植入材料周围有明显的结缔组织包裹，组织学切片观察，发现有结缔组织增生，其间有炎性细胞浸润，有成骨细胞在材料周围规则排列，有异位成骨趋势，材料周围已有类骨质和软骨样结构出现。术后8W，材料周围组织基本无炎症反应，材料开始有部分降解。术后12W，材料周围组织无炎症反应，材料降解较多，异位成骨的趋势更为明显。术后16W，材料周围无组织炎症反应，无炎症细胞浸润，大部分材料降解，且猪源性异种骨支架材料降解较同种异体骨支架材料降解更为迅速，见到的剩余材料少。电镜观察见术后4W，2种植入材料周围有明显的结缔组织包裹，有结缔组织增生，材料表面较为光滑，材料与包裹的结缔组织间界限明显。术后8W材料表面粗糙，开始有部分降解，材料与包裹在其周围的结缔组织间界限不清，有少量结缔组织伸入材料内部。术后12W材料表面更加粗糙，降解较多，从包裹在材料周围的结缔组织中有大量组织长入材料，材料不完整，见到大量骨片。术后16W材料表面粗糙程度较12W时为甚，基本见不到完整的骨组织，从包裹在材料周围的结缔组织被膜中向材料延伸出大量组织，且猪源性异种骨支架材料降解较同种异体骨支架材料降解更为迅速。 普通培养的细胞在培养后2h即有少量细胞贴壁，差速贴壁与普通培养的细胞在培养48h后完全贴壁，呈多边形，立体感较强，细胞增殖迅速，4d左右趋于单层汇合，细胞界限不清，绝大部分呈梭形或多角形，有时突起较多。差速贴壁与普通培养的细胞在传代后，细胞24h内完全贴壁，3d达到大部分融合，细胞呈梭形或多角形，突起较原代明显减少，传至7代后，细胞仍然保持良好的增殖能力，细胞形态很均匀，形态无明显变化。差速贴壁和普通培养脂肪源间充质干细胞的CD44阳性鉴定显示有大量呈CD44阳性的脂肪源间充质干细胞存在。流式细胞仪检测差速贴壁与普通培养脂肪源间充质干细胞的CD44阳性率分别为86.12±1.55％和74.03±1.06％，具有显著差异性。第2代脂肪源间充质干细胞不表达或较低表达ALP，经成骨诱导7d后ALP染色即有阳性细胞的胞浆被染成灰黑色，随诱导时间延长而阳性细胞增多。油红。染色证实脂肪源间充质干细胞在脂肪诱导下胞浆内出现脂滴，且细胞内脂滴随培养时间延长逐渐增加。 脂肪源间充质干细胞在支架材料中的增殖复合培养后，细胞增殖数均呈现随培养时间延长而增长的趋势。扫描电镜观察到在2种材料上均可见到脂肪源间充质干细胞存活并与材料贴附，细胞呈梭形或者多角形，伸出较多触丝与材料结合。细胞数目随着培养时间的延长而逐渐增加。猪源性异种骨支架材料和人同种异体骨支架材料的脂肪源间充质干细胞内碱性磷酸酶的半定量值变化趋势基本与脂肪源间充质干细胞增殖情况一致，均呈现随培养时间延长，而ALP相对活性有增高的趋势。 结论： 脂肪源间充质干细胞是一种优良的骨组织工程种子细胞，而猪源性异种骨支架材料在理化性能和材料毒性等方面与同种异体骨支架材料接近，完全能够取代人同种异体骨支架材料用于骨组织工程。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照缩略词表

声明

引 言

第一章异种骨支架材料的制备及理化性能研究

1材料与方法

2结 果

3讨 论

参考文献

第二章猪源性异种骨支架材料组织相容性的实验研究

1材料与方法

2结 果

3讨 论

参考文献

第三章差速贴壁法分离培养脂肪源间充质干细胞

1材料与方法

2结 果

3讨 论

参考文献

第四章脂肪源间充质干细胞与异种骨支架材料复合培养构建组织工程骨

1材料与方法

2结 果

3讨 论

参考文献

结论

综述 脂肪源间充质干细胞研究进展

攻读博士学位期间所获成果

致谢