云南红豆杉枝叶中抗癌活性成分的提取工艺与黄酮类化合物的研究

摘要

肿瘤是危害人类生命的疾病，死亡率仅次于心血管疾病，居各类疾病死亡率的第二位。长期以来，寻找抗癌生物资源与天然药物成为各国医学、药学、化学及生物学家的一个共同愿望。近年来，从天然药中提取的抗肿瘤有效成分日益得到人们的重视。天然植物红豆杉中作为广谱抗癌的一天然资源，为越来越多肿瘤患者的医治带来福音。但由于这一天然资源的匮乏，植物中有效含量极低，现有提取工艺和制剂使用过程还存在诸多问题，故有必要对存在的问题进行改善及解决。 本文的主要目的就是希望综合利用红豆杉中的抗癌活性物，使其生产工艺更符合工业化生产，在操作中有更好的可行性，更能体现生产简便、经济环保、安全等要求；本文同时还对红豆杉中的黄酮类化合物还进行了总黄酮富集工艺和细胞药理实验的初步研究，并对含量测定的方法学进行了考察，有利于红豆杉中黄酮化合物的进一步开发利用。 本论文包括六部分内容，其研究方法、结果如下： 1、综述 以计算机检索、手工追溯检索等手段相结合对国、内外有关红豆杉研究文献进行分类综述，对目前国、内外红豆杉的主要研究概况加以合理分析，提出课题研究的方向、意义。2、云南红豆杉中抗癌活性物制备工艺研究方法：利用正交设计试验L9(3<'4>)确定原料药提取工艺为：10倍量90％乙醇提取两次，第一次40分钟，第二次30分钟；醇提液用10倍量水沉；沉淀加6倍量石油醚40℃脱脂；用1mol/L 的NaOH溶液碱洗，除去酸性杂质；以碱性氧化铝柱，以环己烷/丙酮为洗脱溶剂，在环己烷-丙酮(6：4)段富集到所需活性部位，洗脱剂用量为3VB。 结果：富集的有效部位各抗癌成分的含量分别为：紫杉醇：9.45％、三尖杉宁碱：9.63％、10-脱乙酰-巴卡亭III：22.64％、总黄酮：19.15％。 3、金松双黄酮对照品的制备方法：取干燥银杏叶以95％乙醇超声提取 3 次，提取液合并，减压浓缩，石油醚脱脂后，用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩，经硅胶柱(6cm×80cm)层析，石油醚-乙酸乙酯(9：1～5：5)梯度洗脱，产物用甲醇多次冲淋，再以二甲基甲酰氨溶解，反复重结晶，得黄色粉末结晶。 结果：(1)HPLC检测含量大于95％，符合对照品的要求；(2)理化鉴别实验均与文献吻合；(3)紫外、红外、质谱、核磁共振的光谱结果均与文献值一致，确定产物为金松双黄酮。 4．云南红豆杉枝叶中总黄酮和金松双黄酮的测定及方法学考察方法：利用高效液相(HPLC)和紫外分光光度法，分别测定云南红豆杉枝叶中总黄酮和金松双黄酮的含量。 结果：在波长272nm处测定，云南红豆杉枝叶中总黄酮的线性范围为12～28μg/ml，范围内线性关系良好(r=0.9992)，平均加样回收率96.04％(RSD为2.7％)，总黄酮的平均含量5.01％；金松双黄酮的线型范围为：0.88～4.4μg/ml，进样量与色谱峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999)；平均回收率为95.4％(RSD为3.5％)，平均含量为0.147％(RSD为2.86％)。 5．云南红豆杉中总黄酮富集工艺的研究方法：(1)确立用超声法初提药粉；(2)用L9(3<'4>)正交试验考察脱脂和醇提的工艺参数；(3)用大孔树脂研究总黄酮的富集工艺：考查树脂类型、上样液浓度、洗脱曲线等。 结果：优化工艺为：以超声的方法，15倍量石油醚脱脂30min，重复3次；再用6倍量80％乙醇提取，第一次提取2h，第二次提取1.5小时。选用AB-8型大孔树脂，上样浓度为6mg/ml，湿法装柱，先用水洗脱，水的用量定为1.5～2BV；再用20％乙醇洗脱，用量为1.5～2BV；最后用40％乙醇洗脱，用量为1.5～2BV。总黄酮的含量为51.26％。 6．总黄酮和金松双黄酮药理活性的初步研究方法：取金松双黄酮、总黄酮提取物，总提取物，依次编为药物1、2、3号并以少量二甲基亚砜(DMSO)溶解，加生理盐水稀释至规定浓度，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，4℃保存。用MTT 法研究各药物分别对肝癌HePG2细胞、肺癌A549细胞、白血病K562细胞增殖的影响。将药物配成50、100、150(μg/孔)浓度的溶液。根据测定的吸收度，计算不同浓度药物对细胞增殖的抑制率，以抑制率为纵坐标，给药浓度为横坐标绘制抑制率曲线。 结果：各药物在不同浓度对细胞增殖均表现出一定的抑制作用，抑制能力：药物2)药物1)药物3；各药物在中、高浓度时对白血病细胞K562的抑制率均大于50％。 本文结论：通过研究，确定了云南红豆杉枝叶中抗癌活性物的提取工艺，所用方法简便、价廉、环保，为进一步药理、制剂工作的开展打好了工艺基础；对云南红豆杉枝叶中黄酮类成分进行了系统研究，包括对照品的制备、含量的测定，富集工艺的研究及初步的药理学实验，为进一步抗癌活性成分筛选和开发利用提供了理论依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述与研究意义

第一节文献综述

1红豆杉的简况

2红豆杉中的黄酮化合物

3红豆杉的开发概况

第二节本研究的目的和意义

参考文献

第二章云南红豆杉抗癌活性成分提取工艺的研究

1前言

2试验材料、仪器和统计方法

3含量分析方法

4工艺过程

4.1原料的前处理

4.2溶剂初提

4.3溶剂萃取

4.4过柱富集

4.5结果与讨论

参考文献

第三章云南红豆杉枝叶中黄酮化合物的研究

前言

第一节金松双黄酮对照品的制备

1仪器与材料

2提取分离

3鉴定

4结论与小节

附图：1H-NMR和13C-NMR图谱

参考文献

第二节云南红豆杉枝叶中总黄酮及金松双黄酮含量测定

1仪器、试剂与样品

2红豆杉总黄酮含量测定方法研究

3 HPLC法测定金松双黄酮的含量

4小结

第三节云南红豆杉枝叶中总黄酮富集工艺的研究

1仪器、试剂与样品

2试验内容

第四节总黄酮和金松双黄酮药理活性的初步研究

1材料与仪器

2试验方法

3实验结果

4结果分析

研究生阶段学术成果

致谢