糖尿病对大鼠牙周组织、白细胞介素-6表达及血清超敏C反应蛋白水平的影响

摘要

糖尿病是一种系统性疾病，由于糖类，脂肪代谢不良导致高血糖和高血脂；牙周组织疾病是发生在牙周支持组织（牙龈、牙周膜、牙槽骨）的一种破坏性疾病，最终会导致牙齿缺失。尽管存在一些争议，关于糖尿病和牙周组织疾病的一些相关关系已经被很多学者报道，因此将牙周组织疾病列为糖尿病的第六大并发症，糖尿病和牙周组织疾病之间的双向关系也成为众多学者关注的热点。临床观察证明，糖尿病患者牙周疾病患病率增高，严重性增加，并且其菌斑指数、牙龈指数、牙周袋深度、牙周附着丧失及牙槽骨吸收程度均高于健康人，可能是牙周疾病发展过程中的一个重要的危险因素；动物实验中，在引入外界刺激因素的情况下，如丝线结扎，菌斑接种等，牙周组织骨丧失在糖尿病大鼠中明显加重，而无外界刺激因素时糖尿病对大鼠牙周组织的影响尚未见明确详细报道。本论文主要研究在没有外界刺激因素的情况下，糖尿病对SD大鼠牙周组织及对炎症因子如白细胞介素-6和超敏C反应蛋白的影响。 目的： （1）建立2型糖尿病SD大鼠模型； （2）比较不同时间点，正常对照组大鼠和糖尿病模型组大鼠牙周组织情况； （3）比较不同时间点正常组SD大鼠和模型组大鼠颌骨和股骨骨组织X线结构； （4）比较不同时间点光镜下正常组SD大鼠和模型组大鼠骨组织结构； （5）比较正常组和模型组大鼠骨组织IL-6免疫组织化学结果； （6）比较正常组和模型组大鼠血清超敏C反应蛋白水平。 方法： 1．SD大鼠随机分为正常对照组和STZ致糖尿病模型组，对照组8只，模型组30只。模型组大鼠高热量饲料喂养1个月后，造成肥胖模型，然后一次性静脉注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）（55mg/kg体重），以造成糖尿病模型；正常对照组大鼠使用普通饲料喂养1个月后，一次性静脉注射0．1mol/L，pH4．5相同剂量的柠檬酸缓冲液：监测尿糖血糖改变情况，尿糖+++，血糖值≥11．2mmol/L，该指标至少持续2周的实验动物作为成功的糖尿病大鼠模型。 分别于实验开始第6，10，12，16周后，随机选取大鼠称取体重，每次对照组取2只，实验组7只，3%戊巴比妥钠麻醉，每只大鼠采血5-7ml，3000r/min离心15分钟，取血清，分装保存于-70℃超低温冰箱。取上下颌骨及双侧股骨，一侧股骨置于4%福尔马林液固定备用，另一侧置于-70℃低温冰箱保存。 2．牙周附着情况：大鼠麻醉后，观察牙龈色、形、质改变及牙龈退缩情况，牙周探针探查大鼠牙周情况。 3．骨组织X线观察：去除颌骨及股骨上的神经肌肉，暴露完整的骨组织，在数字化牙片X光机上拍摄骨组织的X线片，工作条件：电压63Kv，电流8mA，曝光时间0．080s。 4．骨组织形态学观察：经4%福尔马林液固定24小时后，取一半颌骨及一侧股骨，口腔科慢速涡轮机沿股骨长轴及颌骨近远中方向制备成5mm厚的骨块，将骨块进行石蜡包埋，股骨标本沿长轴制备5-7um切片，颌骨标本制作为近远中方向为5-7um的切片，HE染色。 5．大鼠骨组织IL-6免疫组织化学：糖尿病大鼠骨组织石蜡切片按常规脱蜡复水，双氧水灭活内源性过氧化物酶，枸橼酸盐缓冲液进行热抗原修复，5%牛血清白蛋白封闭后，将IL-6按1：20，1：40，1：80，1：100比例稀释，37℃恒温箱孵育一小时左右；加生物素化山羊抗鼠IgG，放于37℃恒温箱孵育20分钟；加SABC，37℃恒温箱孵育20分钟；DAB显色5-30分钟，光镜下观察。 6．大鼠血清超敏C反应蛋白的测定：采用免疫散射比浊法，按照说明书编辑参数，测定结果。正常值为0～1mg/L。 结果： 1．从血糖测定结果及尿糖监测结果看，SD大鼠静脉一次性注射链脲佐菌素可成功的建立二型糖尿病大鼠模型，在整个实验过程中模型组除2只SD大鼠外，其它动物在给药后血糖尿糖均有明显改变，模型组动物在注射链脲佐菌素后一周尿糖增高为+++，血糖均高于11．2mmol/L。 2．牙周组织探查结果：整个实验过程中，正常对照组和模型组大鼠牙龈形状、质地没有出现明显异常，未发现牙龈萎缩，牙周探查深度均维持在初始水平，模型组大鼠后期牙龈颜色轻微发红，牙龈出血指数较对照组稍稍偏高。 3．骨组织X线检查结果：正常对照组大鼠整个实验过程牙槽嵴高度无明显改变，实验开始至第10周时，对照组和模型组大鼠牙槽骨在X线片上未见明显异常，牙槽嵴顶白线清晰可见，股骨骨皮质稍显增厚；第12周模型组大鼠牙槽骨及股骨出现骨密度减低区伴有骨小梁的吸收，X线片呈现透射影像。 4．骨形态学观察结果：在整个实验过程中，对照组大鼠的股骨与颌骨骨皮质、骨小梁结构清楚，在镜下可看到骨小梁走行向各个方向，形态不一，交织成网；糖尿病大鼠牙槽嵴高度无明显改变，自第12周可观察到股骨及颌骨骨吸收活跃，骨皮质变薄，骨小梁变细，HE染色破骨细胞及骨吸收陷窝明显可见。 测量骨皮质厚度和骨小梁数目，以健康对照组大鼠作为标准进行比较，除第10周外，各组之间均有差异（F=60．729，P=0．000），糖尿病模型组大鼠骨皮质厚度第6周与正常组差异性显著，P值为0．015，开始变薄；第10周糖尿病模型组大鼠骨皮质厚度与正常对照组统计学上无差异（P>0．05），可能是由于骨外膜反应性增厚引起的；第12，16周模型组骨皮质厚度与正常组差异性显著（P均为0．000，P<0．05），与正常对照组相比骨皮质变薄；糖尿病组大鼠骨小梁数目在五组之间有差异（F=11．270，P=0．000），第6，12，16周骨皮质厚度与正常对照组相比均有差异（P<0．05），骨小梁数目减少；第6周糖尿病组大鼠骨小梁数目与正常组统计学上无差异（P=0．135，P>0．05）；第10，12，16周骨小梁数目与正常组差异性显著（P分别为0．041，0．001，0．000，P<0．05），骨小梁数目减少。 5．骨组织IL-6免疫组织化学反应结果：正常大鼠的骨组织IL-6免疫组织化学结果显示：淡黄色染色弥散颗粒包绕骨小梁和骨髓腔；糖尿病组大鼠整个髓腔内，可见黄色染色弥散颗粒包绕骨小梁，与正常组骨组织相比没有明显差异，统计学分析无差异。 6．大鼠血清超敏C反应蛋白的测定结果：糖尿病模型组超敏C反应蛋白与正常对照组比较统计学意义显著，P值为0．000（P<0．01），高于正常对照组，糖尿病模型组大鼠血糖，甘油三酯和正常对照组大鼠相比差异性显著，P值分别为0．000，0．002（P<0．01），而总胆固醇两组数值无统计学意义，P值为0．401（P>0．05），变化不明显。 结论： 1．SD大鼠静脉一次性注射链脲佐菌素可成功的建立二型糖尿病大鼠模型，在给药后血糖尿糖均有明显改变，模型组动物在注射链脲佐菌素后一周尿糖增高为+++，血糖均高于11．2mmol/L。 2．模型组大鼠和正常对照组在整个实验过程中，牙周组织改变不明显，可以认为在没有外界刺激因素的情况下，糖尿病并不能作为一个单独的病因引起牙周病。 3．糖尿病模型组和正常对照组大鼠骨组织IL-6免疫组织化学反应差别不大，提示骨组织中IL-6的表达是很少量的。 4．糖尿病模型组大鼠血清中超敏C反应蛋白水平显著高于正常对照组，急性时相炎症因子出现，说明机体处于炎症状态，对于牙周组织疾病的发生是一个危险信号。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献回顾

第一节糖尿病对牙周组织的影响

第二节IL-6及C反应蛋白与糖尿病和牙周病的关系

前言

技术路线

第二章糖尿病大鼠牙周组织的改变

1材料与方法

2.结果

3讨论

第三章糖尿病大鼠白细胞介素-6表达及血清超敏C反应蛋白水平的改变

1.材料与方法

2.结果

3.结论

全文总结

参考文献

附录

致 谢

统计学证明