吉西他滨、培美曲塞及埃罗替尼联合对人胰腺癌细胞BXPC-3及PANC-1生长的影响及机制探讨

摘要

胰腺癌是一种恶性程度极高的消化道肿瘤，近年来发病率有上升趋势。全世界每年约20万人死于胰腺癌。其恶性程度高，进展快，且具有发现晚、病程短、转移早、预后差等特点，被称为“癌中之王”。在确诊时，只有不到10%的胰腺癌是可以切除的，5年存活率小于5%，在所有癌症中5年生存率最低。胰腺癌细胞具有特殊的生物学特性，除吉西他滨外对其他化疗不甚敏感。虽然美国NCCN和欧洲ESMO临床指南均把吉西他滨作为转移性胰腺癌的一线化疗药物，但对提高转移性胰腺癌的作用仍有限，转移性胰腺癌吉西他滨治疗后中位生存期仅5.65月，1年生存率仅为16%～19%。为进一步提高吉西他滨治疗晚期胰腺癌的效果，许多药物与吉西他滨联合治疗晚期胰腺癌，包括5-氟尿嘧啶、顺铂、卡培他滨、多西紫杉醇等。虽然联合化疗的有效率得到一定提高，肿瘤相关症状也有一定的改善，但上述药物与吉西他滨联合的大规模随机临床研究都未能显示出比吉西他滨单药具有更好的生存获益，胰腺癌的化疗走到了一个平台期，如何实现治疗效果上的突破是国内、外肿瘤界面临的一个严峻挑战。 分子靶向治疗针对细胞内或表面特定分子，特异性强，不良反应少，是目前肿瘤治疗的一个研究热点。表皮生长因子受体（EGFR）是受体ErbB家族的一员，可促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡、提高肿瘤细胞的运动、黏着和侵袭能力，从而增加肿瘤向周边及远处侵袭转移的机会，研究表明EGFR的过表达影响胰腺癌细胞的生长。埃罗替尼是小分子酪氨酸激酶机制剂（EGFR-TKIs），一项埃罗替尼联合吉西他滨治疗进展性胰腺癌的Ⅲ期临床试验结果显示，与单药吉西他滨相比，埃罗替尼联合吉西他滨的中位生存期明显延长（6.24月vs5.91月，p=0.034）；1年生存率分别为23%和17%。2005年11月美国FDA批准埃罗替尼用于晚期胰腺癌一线治疗。埃罗替尼联合吉西他滨虽提高了生存期，但中位生存时间及1年生存率提高有限，如何提高分子靶向药物和化疗联合治疗晚期胰腺癌的疗效是医学界面临的问题。EGFR-TKIs与化疗序贯用药治疗非小细胞肺癌优于同时给药，对胰腺癌，二者序贯用药是否优于同时给药目前国内外缺乏基础和临床研究结果。本研究的第一个目的是探讨吉西他滨与埃罗替尼不同用药时序联合对人胰腺癌细胞BXPC-3及PANC-1生长是否具协同作用，并从细胞周期角度分析其可能的细胞学机制。 培美曲塞是多靶点抗叶酸合成的药物，基础研究显示培美曲塞能抑制胰腺癌细胞PANC-1的增值，Ⅱ期的临床研究表明，培美曲塞对晚期胰腺癌疗效突出，且副作用小，与吉西他滨联合对抑制胰腺癌细胞生长具协同作用。另外，鉴于培美曲塞与埃罗替尼联合应用于非小细胞肺癌存在时序效应，在胰腺癌未见类似报道，本研究第二个目的是探讨培美曲塞分别与吉西他滨及埃罗替尼不同用药时序联合对人胰腺癌细胞BXPC-3及PANC-1生长是否具协同作用，并从细胞周期角度分析其可能的细胞学机制，为临床更好的治疗晚期胰腺癌提供实验室依据。 第一部分 EGFR mRNA及蛋白在BXPC-3及PANC-1细胞中的表达。 四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测两株细胞生长，RT-PCR法和Western blot法分别检测两株细胞中EGFRmRNA及蛋白表达。实验结果以均数±标准差（X±S）表示，相关数据采用SPSS13.0软件进行分析，两组之间比较采用t检验，P<0.05判定为差异有统计学意义。结果显示： 1.两株细胞在接种后第2-7天呈对数生长，此阶段最适合进行细胞生长实验。 2.两株细胞均有EGFRmRNA及蛋白表达。 3.BXPC-3细胞EGFRmRNA（t=9.571，P=0.001）及蛋白（t=10.935，P=0.000）表达量高于PANC-1细胞。 第二部分吉西他滨、培美曲塞及埃罗替尼联合对BXPC-3及PANC-1细胞生长的影响。 MTT比色法检测两株细胞生长。实验结果以均数土标准差（X±S）表示，相关数据采用，SPSS13.0软件进行分析，两组之间比较采用t检验；多组之间比较采用one-way ANOVA方差分析，而后不同组间比较采用LSD检验，P<0.05判定为差异有统计学意义。结果显示： 1.吉西他滨（3×10-10～3×10-2mol/L）明显抑制两株细胞的生长，作用呈浓度依赖性（F=86.765，P=0.000； F=85.260，P=0.000）和时间依赖性（F=135.385，P=0.000； F=134.132，P=0.000）；培美曲塞（1.7×10-10～1.7×10-2mol/L）明显抑制两株细胞的生长，作用呈浓度依赖性（F=70.120，P=0.000；F=81.573，P=0.000）和时间依赖性（F=70.025，P=0.000； F=56.772，P=0.000）；埃罗替尼（10-6～104 mol/L）明显抑制两株细胞的生长，作用呈浓度依赖性（F=22.180，P=0.000； F=15.517，P=0.000）和时间依赖性（F=44.354，P=0.000； F=7.813，P=0.000）。吉西他滨（3×10-9～3×106mol/L）（t=2.821，P=0.018；t=2.146，P=0.048； t=2.274，P=0.046； t=2.278，P=0.046）、培美曲塞（1.7×104～1.7×10-2 mol/L）（t=3.120，P=0.011； t=2.677，P=0.038；t=2.440，P=0.035）及埃罗替尼（10-6～10-4 mol/L）（t=3.390，P=0.008；t=3.896，P=0.005；t=5.777，P=0.000）对EGFRmRNA及蛋白高表达的BXPC-3细胞抑制作用均强于EGFRmRNA及蛋白低表达的PANC-1细胞。吉西他滨抑制BXPC-3及PANC-1细胞生长的IC50值分别为31.57±1.79μmol/L和59.17±1.78μmol/L。培美曲塞抑制BXPC-3及PANC-1细胞生长的IC50分别为39.86±1.68μmol/L和83.76±1.75μmol/L。埃罗替尼对BXPC-3及PANC-1细胞的抑制作用在10-6～10-4 mol/L浓度范围未达50%，未能得出IC50值。 2.三种药物不同用药时序联合对两株细胞生长的影响与给药次序有关，吉西他滨与埃罗替尼同时给药（P=0.034；P=0.049）或先用埃罗替尼后用吉西他滨（P=0.001； P=0.025）对两株细胞的抑制作用都显著增强；埃罗替尼与培美曲塞同时给药（P=0.016；P=0.049）和24h序贯给药（P=0.000；P=0.000）对两株细胞的抑制作用都显著增强，其中以先用培美曲塞24h后用埃罗替尼对两株细胞的抑制作用最强（P=0.038； P=0.029）；吉西他滨与培美曲塞同时给药（P=0.049；P=0.044）和24h序贯给药（P=0.000；P=0.000）对两株细胞的抑制作用都显著增强，其中以先用培美曲塞24h后用吉西他滨对两株细胞的抑制作用最强（P=0.038；P=0.022）。 第三部分吉西他滨、培美曲塞及埃罗替尼对BXPC-3细胞周期的影响。 流式细胞术测细胞周期。实验结果以均数士标准差（X±S）表示，相关数据采用SPSS13.0软件进行分析，多组之间比较采用one-way ANOVA方差分析，而后不同组间比较采用LSD检验，P<0.05判定为差异有统计学意义。结果显示： 1.与对照组相比，吉西他滨单药及埃罗替尼单药、吉西他滨与埃罗替尼同时给药及序贯用药均将BXPC-3细胞周期阻断在G1期（P=0.002）；埃罗替尼与培美曲塞同时给药（P=0.046）及先用埃罗替尼后用培美曲塞（P=0.004）将BXPC-3细胞周期阻断在G1期，先用培美曲塞后用埃罗替尼将BXPC-3细胞周期阻止在S期（P=0.026）；培美曲塞单药（P=0.025）及先用培美曲塞后用吉西他滨（P=0.001）将BXPC-3细胞周期阻止在S期，先用吉西他滨后用培美曲塞（P=0.003）及吉西他滨与培美曲塞同时给药（P=0.048）将BXPC-3细胞周期阻止在G1期。 结论：两株细胞均有EGFRmRNA及蛋白表达，BXPC-3细胞EGFRmRNA及蛋白表达量高于PANC-1细胞。吉西他滨、培美曲塞及埃罗替尼呈浓度依赖性和时间依赖性抑制两株细胞生长，且对EGFRmRNA及蛋白高表达的BXPC-3细胞抑制作用强于EGFRmRNA及蛋白低表达的PANC-1细胞。三种药物不同用药时序联合对两株细胞生长的影响与给药次序有关，吉西他滨与埃罗替尼同时给药或先用埃罗替尼后用吉西他滨对两株细胞的抑制作用都显著增强；吉西他滨（埃罗替尼）与培美曲塞同时给药和24h序贯给药对两株细胞的抑制作用都显著增强，其中以先用培美曲塞24h后用吉西他滨（埃罗替尼）对两株细胞的抑制作用最强。先用培美曲塞后用吉西他滨（埃罗替尼）对抑制细胞生长的增强作用可能与对细胞周期的影响有关；吉西他滨与埃罗替尼同时给药及序贯用药、埃罗替尼与培美曲塞同时给药及先用埃罗替尼后用培美曲塞、吉西他滨与培美曲塞同时给药及先用吉西他滨后用培美曲塞对抑制细胞生长的增强作用可能与对细胞周期的影响无关。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章EGFR mRNA及蛋白在BXPC-3及PANC-1细胞中的表达

引言

材料和方法

结果

小结

第二章吉西他滨、培美曲塞及埃罗替尼联合对BXPC-3及PANC-1细胞生长的影响

引言

材料和方法

结果

小结

第三章吉西他滨、培美曲塞及埃罗替尼对BXPC-3细胞周期的影响

引言

材料和方法

结果

小结

讨论

结 论

参考文献

综述 吉西他滨与靶向药物联合治疗胰腺癌研究进展

创新与意义

附录 统计学证明

在读期间发表的论文

致谢